暴露于爆炸冲击的退伍军人加速表观遗传衰老

《The Journal of Head Trauma Rehabilitation》：Accelerated Epigenetic Aging in Veterans Exposed to Blast

目标：确定终身爆炸暴露严重程度是否与9/11后退伍军人的加速生物学衰老独立相关。

设置：美国东南部退伍军人事务医疗中心。

参与者：共纳入114名9/11后战斗退伍军人（43.0 ± 9.6岁；88.6%为男性），均完成了详细的临床访谈并提供了全血DNA样本。

设计：对参与2项协调的退伍军人事务研究方案的参与者进行横断面分析：慢性神经创伤效应联盟研究34（CENC-34）和部署后心理健康研究（PDMH）。

主要测量指标：通过临床访谈评估终身爆炸暴露严重程度（索尔兹伯里爆炸访谈）、创伤后应激障碍（PTSD）诊断（DSM-5临床管理PTSD量表）和轻度创伤性脑损伤（TBI）病史（中大西洋MIRECC创伤性脑损伤评估）。生物学衰老使用DunedinPACE测量，这是一种基于全血DNA甲基化数据得出的衰老速度表观遗传生物标志物。分层线性回归检验了爆炸暴露、PTSD和TBI的加和效应和交互效应，并对人口统计学和技术协变量进行了调整。

结果：爆炸暴露严重程度越大，DunedinPACE评分越快（B = 0.12；P = .042），表明生物学衰老加速。轻度TBI病史也与更快的衰老独立相关（B = 0.50；P = .036），而PTSD诊断则无关（B = 0.01；P = .970）。未观察到显著的交互效应。探索性分析表明，更高强度、更频繁的爆炸暴露有助于加速衰老。

结论：终身爆炸暴露严重程度与9/11后退伍军人的表观遗传加速衰老独立相关，即使在考虑PTSD和TBI之后依然如此。这些发现表明，爆炸暴露可能促进生物学衰老过程，从而导致长期健康衰退。加速的生物学衰老可能代表了一条将爆炸暴露与衰老相关疾病易感性增加联系起来的路径，并可通过DunedinPACE等生物标志物指导早期识别高危退伍军人。

20多年持续的军事行动使数百万美国军人在作战和训练环境中暴露于爆炸超压力。虽然并非所有爆炸都会导致创伤性脑损伤（TBI），但即使是亚损伤性暴露也与长期神经生物学变化和不利健康结果相关。先前的研究已记录爆炸暴露与可诊断的TBI以外的症状负担增加、认知功能降低和精神疾病合并症增加相关。然而，将爆炸暴露与这些慢性健康影响联系起来的生物学机制仍然知之甚少。

加速的生物学衰老已成为军事暴露（如TBI）与长期健康风险之间联系的一个潜在机制途径，包括慢性病易感性增加、认知功能衰退和早逝。近期在生物学衰老评估方面的进展，特别是DunedinPACE等表观遗传衰老时钟，使得能够在细胞水平上敏感地检测加速衰老。退伍军人的研究表明，TBI和PTSD都与更快的表观遗传衰老相关；然而，这些研究并未考虑爆炸暴露可能产生的不同效应。

我们此前的研究表明，TBI的存在和频率与9/11后退伍军人的表观遗传加速衰老相关。在该分析中，与部署相关的TBI被发现与任何TBI病史相比具有更强的相关性，表明部署环境（例如物理/情感应激源、高水平爆炸暴露）具有特定效应。PTSD也被发现是一个贡献因素，与先前在同一样本中的工作一致，但共享方差限制了对独特效应进行隔离的能力。本分析的目标是在此基础上评估爆炸暴露是否对加速的表观遗传衰老有独立贡献。爆炸暴露普遍存在于军事环境中，可能通过神经炎症、氧化应激或血管功能改变等机制产生神经生理学效应。评估其对细胞衰老的潜在影响对于了解退伍军人爆炸暴露的长期健康风险至关重要。

本研究评估了爆炸暴露严重程度与表观遗传衰老之间的相关性，样本为参与了两项相关研究方案的9/11后战斗退伍军人。在先前将TBI和PTSD与加速表观遗传衰老联系起来的工作基础上，本分析专门关注爆炸暴露严重程度是否与更快的生物学衰老相关。我们假设，在考虑终身PTSD诊断和TBI病史之后，爆炸暴露严重程度越大，与加速的表观遗传衰老显著相关。同样，基于先前的工作，我们预计PTSD和TBI病史对加速的表观遗传衰老具有加和效应，即使在考虑爆炸暴露严重程度之后仍然显著。

方法

参与者

这些分析的数据来自一个便利样本，共114名参与了两项研究的退伍军人。特征和临床表征数据来自慢性神经创伤效应联盟研究34（CENC-34），DNA甲基化（DNAm）数据来自部署后心理健康（PDMH）研究。本分析的纳入标准是：1）参加CENC-34和PDMH的研究；2）在PDMH中可获得DNAm数据。研究描述如下。图1展示了纳入分析的流程。最终分析样本量为N = 114。

CENC-34：2016年至2019年开展的一项单中心研究，纳入了9/11后战斗退伍军人（N = 341）。纳入标准：年龄18岁或以上，在2001年9月11日之后部署至战区，并有战斗暴露（定义为部署风险与韧性清单D部分得分>17；DRRI-2-D）。排除标准：中重度TBI或穿透性头部外伤终身病史；部署背景外的轻度TBI伴任何意识丧失；重大神经系统疾病史（如中风、癫痫、脊髓损伤）；严重精神疾病史（如双相障碍、精神分裂症）；当前神经认知障碍、物质使用障碍或精神病。

PDMH：2005年至2018年开展的退伍军人整合服务网络（VISN）-6精神疾病研究、教育和临床中心（MIRECC）多中心研究，纳入了美国退伍军人（N = 3876）。PDMH的唯一纳入标准是在2001年9月11日或之后有美国军事服役经历。参与者作为PDMH的一部分提供了血液样本。

伦理审批、注册和知情同意

CENC-34获得了索尔兹伯里退伍军人事务医疗系统机构审查委员会（IRB）的批准。PDMH获得了索尔兹伯里退伍军人事务医疗系统、达勒姆退伍军人事务医疗系统和里士满退伍军人事务医疗中心IRB的批准，各IRB对其所在场所的研究活动提供监督。所有参与者在开始两项研究活动前均提供了书面知情同意。

测量指标

生物学衰老

使用DunedinPACE算法评估表观遗传衰老，该算法应用于PDMH队列的DNA甲基化数据，详细描述见先前工作。全血样本使用Infinium HumanMethylation450或MethylationEPIC Beadchip（Illumina Inc, San Diego, CA）分析甲基化CpG位点。使用minfi和ChAMP R包进行质量控制。使用R包wateRmelon进行探针质量控制和数据标准化。使用Dasen方法对原始beta值进行标准化，使用R包sva中的ComBat实现批次和芯片调整。

白细胞计数

使用FlowSorted.Blood.450k和FlowSorted.Blood.EPIC包估算主要类型白细胞的细胞计数比例：T淋巴细胞（CD4+和CD8+）、B细胞（CD19+）、单核细胞（CD14+）、NK细胞（CD56+）和中性粒细胞。

甲基化衍生吸烟

使用DNA甲基化算法评估终身烟草烟雾暴露，以生成甲基化评估吸烟指数。

临床和诊断访谈

终身爆炸暴露使用索尔兹伯里爆炸访谈（SBI）评估，这是一种半结构化访谈，旨在表征一生中爆炸和爆炸物的暴露情况，独立于创伤性脑损伤（TBI）。SBI系统地收集所有报告的爆炸暴露事件级别的详细信息，无论来源、背景、距离或伤害结果如何，包括训练、部署、战斗和民用环境中的事件。对于每次爆炸事件，参与者根据行为锚定评分（0-5）对多个爆炸特征的主观体验进行评分，包括感受到的压力梯度、风力、碎片、地面震动、温度变化和声音，以及估计的爆炸距离和背景因素（如防护掩体或车辆参与）。

在本分析中，爆炸暴露严重程度操作化为最大终身压力严重程度，定义为SBI压力量表上所有爆炸事件中报告的最高压力评分（0 = 无压力，5 = 与损伤相关的极端压力）。该指标基于先前的实证评估预先选定，证明最大压力严重程度是不利神经行为和健康结果的稳健且具有临床意义的指标，与基于频率或加权综合方法相比表现良好。鉴于缺乏经验证的累积爆炸指标，且不同爆炸暴露操作定义在不同结局领域产生不同的关联，该方法旨在最小化误分类的同时保留可解释性。

为更全面地表征爆炸暴露，探索性分析还检查了其他SBI衍生的爆炸特征，包括压力阈值、超过这些阈值的暴露频率、估计距离、爆炸相关TBI和其他事件特征。这些分析结果见补充文件表1，并在结果中总结。

CAPS-5：使用DSM-5临床管理PTSD量表（CAPS-5）确定终身PTSD诊断。终身PTSD诊断以二分类方式表示（参照组：无诊断）。

MMA-TBI：中大西洋MIRECC创伤性脑损伤评估（MMA-TBI）根据VA/DoD TBI临床实践指南评估TBI的存在和严重程度。轻度TBI终身病史纳入分析（参照组：无病史）。轻度TBI频率在探索性分析中进行了评估，但与DunedinPACE评分独立不相关（P = .403），未保留在最终模型中。超过轻度TBI的个人不符合CENC-34资格；因此，本样本中的所有TBI均为轻度。

数据分析

在SAS Enterprise Guide 8.3中进行分析。评估变量的正态性假设。线性回归评估了终身PTSD诊断、轻度TBI终身病史、爆炸暴露终身病史和最大爆炸暴露严重程度对DunedinPACE评分的个体描述性效应。分层线性回归用于评估终身PTSD诊断、终身TBI病史和爆炸暴露严重程度对DunedinPACE评分的加和贡献。DunedinPACE评分从更广泛的PDMH样本（N = 2309）的基线表观遗传数据进行了z-score标准化，以明确解释。方差膨胀因子范围为1.08至1.65，表明低共线性。结果中报告了非标准化回归系数（B）。排除女性的敏感性分析显示爆炸暴露严重程度的效应量高度相似，支持了结果的稳健性，尽管性别间样本量不均衡。

协变量

甲基化芯片类型、细胞计数比例和甲基化衍生吸烟作为技术协变量纳入所有模型。人口统计学协变量包括PDMH就诊时的年龄（即血液采集时）、性别、种族少数群体地位、CENC-34与PDMH就诊之间的年数、以及最近一次爆炸事件以来的年数（对于未暴露于爆炸的个人，以最近一次部署以来的年数代替），并纳入所有回归模型。教育作为潜在协变量进行了评估，但与DunedinPACE评分不显著相关，因此未保留在最终模型中。几种免疫细胞比例（如CD8+ T细胞、NK细胞）与DunedinPACE z-score显著相关，与先前该生物标志物的验证研究一致，并作为协变量纳入以减少生物学混杂。吸烟暴露使用甲基化衍生吸烟指数评估，该指数捕获累积烟草暴露并部分考虑生活方式相关的 cardiometabolic 风险。

数据可用性

本文章未发表的去标识数据可在合理要求下提供。

结果

分析样本包括101名男性（88.6%）和13名女性（11.4%），平均年龄43.0岁（SD = 9.6；表1）。总计，67.5%的样本有终身PTSD诊断（n = 77），83.3%（n = 95）有TBI终身病史。

表1 样本特征（N = 114）

| 特征 | M或n | SD或% | 范围 |
|------|------|-------|------|
| 男性 | 101 | 88.6% | — |
| 年龄 | 42.98 | 9.59 | 27–60 |
| 受教育年限 | 15.20 | 2.16 | 12–22 |
| 种族/族裔少数群体 | 49 | 43.0% | — |
| 爆炸暴露 | 84 | 73.7% | — |
| 最大压力（n = 84） | 2.62 | 1.19 | 1–5 |
| 终身PTSD诊断 | 77 | 67.5% | — |
| 终身TBI病史 | 95 | 83.3% | — |
| 部署TBI（n = 95） | 64 | 67.4% | — |
| 爆炸事件/战斗部署以来的年数 | 10.45 | 3.34 | 1.09–20.68 |
| DunedinPACE z-score | ?0.15 | 1.06 | ?2.09至3.95 |

注：年龄指PDMH参与期间血液采集时的年龄。

参与PDMH与CENC-34之间的平均时间（年）为 M = 6.43，SD = 3.23，范围 = 0–12，该变量作为协变量纳入所有分析。所有其他呈现的数据均为CENC-34收集的部分。种族/族裔少数地位以白人（非西班牙裔）（ref. = 0）为参考组。爆震暴露（0 = 无）的判定标准为个体报告的SBI压力量表中一生中最大压力值≥1。最大压力和部署期间脑震荡仅针对分别有爆震暴露或脑震荡史的个体呈现。对于未接受爆震暴露的个体，在计算距爆震事件的时间（n = 84有爆震暴露者；M = 10.56，SD = 2.08）时，插入了距最近一次部署的年限（n = 30未暴露者；M = 10.54，SD = 3.08）。

未调整效应
简单线性回归检验了感兴趣变量的单独效应，仅调整了技术和人口统计学协变量。爆震暴露严重程度（B = 0.13，P = .026）和脑震荡（B = 0.53，P = .019）与表观遗传加速衰老呈正相关。相反，终生PTSD诊断与DunedinPACE评分无显著关联，B = 0.21，P = .247。

调整后效应
层次线性回归的结果见表2。PTSD诊断对DunedinPACE评分未贡献额外的显著解释变异。

脑震荡史（B = 0.50，P = .036）和爆震暴露（B = 0.12，P = .042）均与DunedinPACE评分升高显著相关，表明两者对加速表观遗传衰老具有独立的效应。图2展示了不同最大爆震压力严重程度的平均DunedinPACE最小二乘均值。

表2
层次线性回归评估DunedinPACE结果（N = 114）

模型 | 全局模型 | 参数估计 | R2 | P | ΔR2 sig | B | SEB | t | P | LLCI | ULCI
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---
协变量（模型0）| 0.404 | <.001 | — | | | | | | | | |
斜体 | 甲基化芯片 | ?0.09 | 0.32 | ?0.28 | .783 | ?0.712 | 0.538
| | CD4T | ?3.13 | 1.83 | ?1.71 | .091 | ?6.76 | 2.507
| | CD8T | ?8.31 | 1.94 | ?4.29 | <.001 | ?12.159 | ?4.467
| | BCell | 7.46 | 3.60 | 2.07 | .041 | 0.319 | 14.602
| | 单核细胞 | 2.40 | 3.59 | 0.67 | .506 | ?4.725 | 9.524
| | NK | ?4.62 | 2.01 | ?2.30 | .024 | ?8.621 | ?0.628
| | 吸烟 | 0.58 | 0.12 | 4.75 | <.001 | 0.339 | 0.825
| | 年龄 | 0.01 | 0.01 | 0.80 | .427 | ?0.013 | 0.030
| | CENC-34与PDMH之间的年限 | ?0.04 | 0.03 | ?1.32 | .190 | ?0.105 | 0.021
| | 性别 | 0.18 | 0.30 | 0.60 | .548 | ?0.417 | 0.781
| | 种族/族裔少数地位 | 0.49 | 0.21 | 2.35 | .021 | 0.076 | 0.907
| | 距爆震事件/战斗的年限 | 0.00 | 0.00 | 1.08 | .285 | ?0.00 | 0.000
PTSD（模型1）| 0.412 | <.001 | 0.117 | | | | | | | | |
| | 终生PTSD | 0.21 | 0.18 | 1.17 | .247 | ?0.148 | 0.567
脑震荡（模型2）| 0.438 | <.001 | <0.001 | | | | | | | | |
| | 终生PTSD | 0.10 | 0.18 | 0.56 | .580 | ?0.263 | 0.468
| | 终生脑震荡史 | 0.50 | 0.23 | 2.13 | .036 | 0.033 | 0.963
爆震暴露（模型3）| 0.461 | <.001 | <0.001 | | | | | | | | |
| | 终生PTSD | 0.01 | 0.19 | 0.03 | .974 | ?0.365 | 0.377
| | 终生脑震荡史 | 0.50 | 0.23 | 2.17 | .033 | 0.042 | 0.956
| | 爆震暴露严重程度 | 0.12 | 0.06 | 2.06 | .042 | 0.004 | 0.229

注：协变量以斜体表示。粗体表示显著主效应。PTSD、脑震荡和爆震暴露模型包含协变量模型中的所有变量。吸烟通过甲基化评估并已标准化。DunedinPACE评分为z分数。

图2
爆震暴露严重程度增加与生物衰老速率增加相关（B = 0.13，P = .026）。这一结果通过在不同最大爆震压力严重程度水平上观察到较高的平均DunedinPACE z分数得以直观展示。该图展示了每个最大压力严重程度水平上的均值和标准误DunedinPACE z分数。DunedinPACE z分数为0表示样本的平均分数；低于均值的分数可解释为表观遗传衰老速率慢于平均水平，而高于零的分数可解释为表观遗传衰老速率快于平均水平。负分数并不代表对衰老速率的绝对负效应；所有参与者的生物衰老速率均为正值。每个最大压力水平所代表的参与人数为：0（n = 30）、1（n = 17）、2（n = 23）、3（n = 26）、4（n = 11）和5（n = 7）。

探索性分析
鉴于先前证据表明，爆震暴露的不同操作性定义与结果之间产生分歧性的关联，我们进行了探索性线性回归分析，检验DunedinPACE z分数与SBI捕获的额外爆震特征之间的关联，包括压力阈值、频率、距离和其他事件特征（补充文档1，表1，可获取于：http://links.lww.com/JHTR/B53）。[27,28] 与图2所示的效应一致，任何压力>3的爆震暴露均显著增加R2（P < .001），并具有独立的显著关联。除任何爆震压力>0（P = .051）、最小距离（P = .084）和最大碎片（P = .774）外，所有其他爆震事件特征在协变量之上解释了显著的额外变异（P值 = .031–<.001），但未达到独立显著性。

讨论
本研究提供了初步证据，表明军事爆震暴露有助于加速表观遗传衰老。这些发现扩展了先前关于PTSD退伍军人加速衰老[14]的研究和脑震荡研究[7]，将爆震暴露确认为该过程中一个独特的贡献因素。这些结果表明，爆震暴露作为一种独特的生理应激源，能够破坏细胞稳态，并促进加速的表观遗传改变，反映出生理年龄更长的个体所具有的生物学特征。

日益增长的文献将爆震相关的脑结构和功能变化与症状表现和认知功能联系起来[17,32–36]。爆震相关的其他血液来源的与衰老和神经创伤相关的标志物升高也与症状表现和认知功能相关联[37,38]。当前结果突出了爆震暴露的另一个潜在后果，这可以作为长期不良结果风险增加的标志物。这些机制也可能与PTSD和脑震荡所涉及的机制重叠，强化了考虑多种共病暴露和损伤的整合模型的重要性。值得注意的是，我们的结果支持爆震暴露对加速生物衰老的效应可能仅在经历过高水平爆震的个体中才表现出来。这与先前工作一致，表明日益严重的爆震暴露史与日益严重的结果按比例相关[2,3,6,27,32,39,40]。这些发现引发了关于爆震暴露如何影响加速生物衰老指标的关键问题。爆震超压可能通过神经炎症级联反应[17]、血脑屏障破坏、氧化损伤或血管功能障碍[17,41–44]诱导全身性生理应激，每一种都与已知的衰老特征相吻合[11,45]。未来需要进一步研究以了解爆震暴露与加速生物衰老之间的联系，以及爆震暴露如何可能导致年龄相关负面状况的更早发生。

当前结果表明，爆震暴露对表观遗传衰老的效应主要受爆震暴露严重程度的影响，严重程度更高的爆震会增加生物衰老速率。探索性分析还表明，更频繁地暴露于高强度爆震可能有助于加速衰老的风险，尽管这些指标未达到独立显著性。这些结果与先前文献一致，表明严重性更高的爆震对不良结果影响最大。这已在包括精神症状[3,6,40]、认知功能[4,5]、脑功能[32]和脑结构[39]在内的结果中得到证实。这些结果之间的相互作用可能是存在的；然而，这些关系刚刚开始被探索。在缺乏爆震暴露共识性操作性定义的情况下，最大压力严重程度代表了一个临床可解释的维度，但它并不能完全捕捉累积性、重复性或低水平的爆震暴露，这些暴露可能因暴露的操作性定义方式不同而与长期结果呈不同的关系[28]。探索性结果与来自动物模型和人体亚脑震荡爆震研究的涌现证据一致，这些研究表明累积暴露负担可能是引起可测量神经生物学后果所必需的。当前结果不仅限于亚脑震荡暴露，亚脑震荡暴露对加速生物衰老的影响仍未知。

值得注意的是，本样本相对年轻，大多数参与者的年龄低于年龄相关疾病的典型发病年龄。尽管DunedinPACE对早期、亚临床的加速生物衰老迹象敏感，并且已被证明可以预测未来身体健康的下降[46]和认知衰退的风险[47]，但爆震暴露对衰老轨迹的全部影响可能尚未完全显现。随着接受爆震暴露的个体年龄增长并进入更容易患心血管疾病、神经退行性疾病和代谢疾病的时期，这些加速表观遗传变化的影响可能变得更加明显。需要进行纵向随访以评估此处观察到的表观遗传特征是否会随时间推移而加剧，或是否能预测早发性疾病。

此外，值得注意的是，在本次分析中，终生PTSD诊断与DunedinPACE无显著关联。这一结果与此前发现相矛盾[14]，可能是因为本研究样本量较小。具体而言，当比较Bourassa等人[14]报告的当前PTSD与DunedinPACE之间的关系（N = 2,309，B = 0.18）和本研究（N = 114，B = 0.21）时，关联大小可比较，但由于样本量不同，统计功效存在差异。Bourassa等人[14]还评估了当前PTSD诊断而非终生诊断；然而，在本样本中，当前和终生PTSD诊断的系数大小相似，且均未与表观遗传衰老显著相关。或者，PTSD、脑震荡和爆震暴露之间的高共病率可能贡献了共享变异，限制了独特效应的检测。

局限性
有几项局限性需要考量。这是一项横断面分析，无法得出因果推断。血液样本采集与临床评估之间存在平均6年的时间间隔，引入了潜在的时序模糊性。然而，参与者在两项研究时均已经是已退役的退伍军人，因此在间隔期间发生新的爆震暴露的可能性较低。此外，我们依赖终生诊断数据和全面的暴露史，并统计调整了评估之间的时间间隔，以减轻潜在的时序差异。适度的样本量限制了统计功效和外部效度。尽管如此，我们的发现与先前关于PTSD和脑震荡相关表观遗传衰老的研究一致，且与该队列的神经认知和精神科结果一致，这支持了其有效性，并强调了加速生物衰老在接受爆震暴露退伍军人中的潜在临床相关性。

关于脑震荡，脑震荡后症状是作为结构化脑震荡访谈的一部分回顾性评估的；然而，当前症状负担未被直接建模。爆震暴露通过最大终生压力严重程度进行操作性定义，这不能捕捉累积剂量、暴露频率或重复性低水平爆震。这些维度可能独立或协同地贡献于长期结果，应在未来研究中使用标准化的、基于共识的暴露框架纳入。

最后，表观遗传衰老受多种健康和生活方式因素影响。尽管吸烟暴露通过甲基化衍生的生活方式相关心脏代谢风险纳入分析，但本队列的体力活动、体重指数和心血管健康指标并非普遍可用，因此无法纳入当前分析。

结论
本研究证明，爆震暴露严重程度与战斗退伍军人加速生物衰老相关。这些发现表明，爆震暴露可能通过细胞衰老机制对长期健康衰退作出贡献，并突出了将DunedinPACE等分子生物标志物纳入退伍军人风险分层中的潜在价值。未来的纵向研究应评估表观遗传衰老是否介导爆震暴露与年龄相关健康结果之间的关系，以及针对衰老生物学的干预措施是否可以减轻这些风险。