基于铂基纳米酶筛选与原位扩增反应（ISAR）产生的焦磷酸偶联，用于心血管疾病相关miRNA-21的双模检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Platinum-based Nanozyme screening coupled with ISAR-generated pyrophosphate for dual-mode detection of cardiovascular disease-associated miRNA-21

• NiPt纳米粒子在四种铂基纳米酶中表现出优越的表观过氧化氢酶（POD）样催化性能。• ISAR产生的焦磷酸（PPi）抑制了NiPt纳米酶活性，可用于miRNA-21响应的检测。• 一种双模态检测方法，将无需仪器的比色法与荧光检测相结合。• 比色法的检测限为50 pM，而荧光法的检测限达到0.227 pM。• 在初步临床研究中，血清miRNA-21检测结果与qRT-PCR结果一致。## 引言心血管疾病（CVD）代表着全球主要的健康负担，造成了大量的死亡和残疾 [1]。心血管疾病构成了重大的全球健康负担，根据美国心脏协会发布的《2024年心脏病与卒中统计更新》，2021年全球约有1991万人因心血管疾病死亡 [2]。随着人口老龄化和心血管风险因素（如饮食不良和肥胖等）的显著增加，心血管疾病在21世纪继续构成严峻的全球健康挑战 [3]。传统的生物成像技术，如超声检查、心电图、动态心电图监测、心脏CT扫描等，在医院中用于心血管疾病的诊断是标准做法。然而，这类工具分辨率有限，通常只能在晚期阶段检测到心血管疾病。大多数生物成像方法还耗时长、劳动强度大，且需要昂贵的设备和经过高度培训的人员。相比之下，血液中特定生物标志物的检测 [4]、[5]（例如肌钙蛋白I/T、C反应蛋白、肌红蛋白和白细胞介素）在早期心血管疾病的诊断中发挥着重要作用。类似地，一些循环miRNA的异常表达水平 [6]（包括miRNA-21、miRNA-155和miRNA-1）已被报道与心血管病理过程相关，并作为心血管评估的潜在循环生物标志物引起了广泛关注 [7]。miRNA通过降解或调控靶mRNA来发挥作用，广泛参与细胞增殖、凋亡、纤维化、炎症反应和代谢调节等关键过程。在心血管系统中，miRNA已被证明可以精细调控多种病理事件，包括心力衰竭、心脏肥大、血管内皮功能、动脉粥样硬化斑块形成等 [8]。其中，miRNA-21已被证明参与多条与心血管病理过程相关的信号通路 [9]、[10]。心肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞中miRNA-21表达的改变已被报道与参与心血管重塑的信号通路相关 [11]。然而，miRNA-21并非完全特异于心血管疾病，因此更恰当地被视为与心血管疾病相关的生物标志物，而非独立的诊断指标。传统方法，如定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、Northern印迹、微阵列分析和下一代测序（NGS），已被确立用于可靠和特异性的miRNA检测 [12]。然而，这些方法通常受到昂贵设备需求、复杂操作步骤和专业技术人员要求的限制。此外，由于miRNA本身的不稳定性、miRNA家族内高度的序列相似性以及普遍较低的表达水平，miRNA的定量分析颇具挑战。因此，miRNA的可靠定量 critically 依赖于能够同时确保miRNA稳定性、实现无需仪器操作、达到高灵敏度并高保真度分辨单核苷酸多态性的分析策略。各种等温扩增策略 [13]，包括滚环扩增、环介导等温扩增、杂交链反应、链置换扩增等，已被开发用于提高miRNA检测的特异性和灵敏度，同时消除对热循环仪设备的需求。其中，基于入侵堆叠引物的扩增反应（ISAR）通过一系列连续的堆叠杂交和介导的链置换，精确地重构引物结合位点，实现了超灵敏且具有序列特异性的miRNA检测 [14]、[15]、[16]。在ISAR过程中，在靶标分析物的存在下，发夹DNA（hDNA）模板经历聚合酶介导的扩增。随着每个核苷酸的掺入，脱氧核苷三磷酸（dNTP）底物释放焦磷酸（PPi）分子。ISAR的启动依赖于miRNA靶标与设计好的hDNA模板之间杂交体的形成，从而将PPi的产生转化为疾病相关miRNA的直接可测量指标 [17]。多种PPi检测方法已被建立，包括比色法、电化学法、酶催化法和基于荧光的检测方法，其中比色法因其简便性和快速性而脱颖而出。近年来，纳米酶作为一种强大的催化材料，因其在构建靶向生物标志物的超灵敏生物传感平台方面的成本效益、高稳定性以及高效的类酶催化活性而备受关注。具体而言，过氧化氢酶（POD）样纳米酶可以催化H?O?的分解，产生羟基自由基，将无色的四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色的氧化态TMB [18]、[19]。先前的研究表明，PPi可以与纳米酶表面相互作用并抑制其POD样活性，为比色PPi传感提供了基础 [20]。因此，这些基于纳米酶的策略也被广泛应用于miRNA检测中。先前的研究已表明，超小尺寸的铂基纳米粒子（NPs）可以增强POD样催化性能 [21]。此外，将过渡金属掺入铂基纳米粒子中可以调节其催化特性，这为开发高效的铂基纳米酶并提供了一条潜在策略，同时减少了对贵金属的消耗 [18]。多种铂基双金属纳米酶已被开发用于比色和荧光生物传感，包括PtAu、PtPd、PtNi、PtCo以及其他铂族金属杂化物，归功于其改善的催化活性、稳定性和可调节的物理化学性质 [22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。这些研究突出了金属-金属协同相互作用为构建用于生物分子检测的高性能POD样纳米酶提供了一种有效的策略。在此，我们首次成功合成了四种掺杂过渡金属的铂基纳米粒子，包括镍-铂纳米粒子（NiPt NPs）、钴-铂纳米粒子（CoPt NPs）、铁-铂纳米粒子（FePt NPs）和锰-铂纳米粒子（MnPt NPs），以寻找具有高效催化性能的铂基纳米酶。然后，选择催化性能最佳的纳米粒子并将其应用于构建用于检测与心血管疾病相关的miRNA-21的比色法和荧光双模态生物传感器。该生物传感器采用由miRNA-21介导的靶标触发ISAR。ISAR过程中产生的PPi抑制了所选铂基纳米酶的POD样活性，从而实现无需仪器的比色miRNA检测。同时，ISAR提供了灵敏的荧光miRNA检测。进一步评估了该双模态生物传感器在血清样本中的miRNA测量能力，以初步评估其在生物基质中的适用性。## 各章节摘要### 材料与试剂本研究中使用的所有材料和试剂详见补充信息。### 该双模态生物传感器检测miRNA-21取100 μL浓度为10 μM的hDNA溶液，在干浴中95 °C加热10分钟，随后立即在冰上冷却。引物和不同浓度的miRNA溶液均在无菌无核酸酶的1× PBS中配制。20 μL ISAR反应体系包含不同浓度的靶标miRNA、0.4 μM hDNA、4 μM引物、5 U Klenow聚合酶、0.25 mM dNTPs、3% DMSO、1 U/μL RNase抑制剂。### 四种铂基纳米酶的设计、合成与表征采用一种简单的单步共还原策略制备了四种铂基双金属纳米粒子，分别标记为NiPt NPs、CoPt NPs、FePt NPs和MnPt NPs。合成过程中使用了约1:1的铂与过渡金属摩尔比作为名义前驱体投料比 [18]、[29]。NiPt、CoPt、FePt和MnPt NPs分别通过将等摩尔的相应过渡金属醋酸盐与乙酰丙酮铂共还原而合成。乙醛作为还原剂。### 结论综上所述，合成了四种掺杂过渡金属的铂基纳米酶，包括NiPt、CoPt、FePt和MnPt NPs，并对其进行了系统评估。基于NiPt NPs表现出有利的表观POD样动力学特性（包括对TMB的低Km值和在测试条件下相对较高的反应速率），将其选择用于后续的传感应用。随后通过将靶标启动的ISAR与PPi介导的方法相结合，开发了一种比色法和荧光双模态生物传感器。## 利益冲突声明作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能对本研究的工作产生影响。## 致谢本研究获得江苏省高校自然科学基金项目（项目编号：24KJB310023）、江苏省卫生厅科研基金项目（项目编号：Z2022007）以及江苏省大学生创新创业训练计划项目（项目编号：X2026103130019）的资助。---明慧·陈 | 洁·朱 | 玲月·许 | 文蓓·刘 | 迪雅·齐