有尾两栖类墨西哥钝口螈幼虫性腺分化过程中Sox9与Vasa基因的表达研究

《Acta Zoologica》：Sox9 and Vasa Gene Expression During Gonadal Differentiation in Larvae of the Urodele Amphibian Ambystoma mexicanum

　　

性分化相关基因（如Vasa和Sox9）的研究具有重要意义，因为它们分别作为生殖系和雄性分化途径的特异性标记。本研究利用免疫荧光（immunofluorescence）技术，表征了有尾两栖类墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）幼虫在发育阶段（stage, S）50、53、55、57及3个月龄时性腺分化过程中Vasa、Sox9及层粘连蛋白（laminin）的表达。在S50和S53阶段，laminin勾勒出性腺-中肾复合体（gonad-mesonephros complex）以及分化中性腺的髓质区（medullary region）和皮质区（cortical region）；Sox9在体细胞核中被检测到，Vasa在生殖细胞细胞质中表达。在S55和S57的性腺分化期间，laminin界定了卵巢腔（ovarian cavity），并在睾丸中围绕睾丸索（testicular cords）；Sox9和Vasa维持了早期阶段的表达模式。在3个月龄的卵巢中，laminin在卵泡周围被检测到，Sox9表达缺失，Vasa在卵母细胞外周细胞质中表达；在睾丸中，laminin围绕睾丸索，Sox9在支持细胞（Sertoli cell）核中表达，Vasa在精原细胞（spermatogonia）中被检测到。这些结果表明，在A. mexicanum中，Sox9和Vasa是保守基因，可能执行与其他脊椎动物中观察到的功能类似的功能。

**解读文章：有尾两栖类墨西哥钝口螈幼虫性腺分化过程中Sox9与Vasa基因的表达研究**

性腺分化是脊椎动物早期胚胎发育中一个由遗传因素精密调控的过程。尽管已鉴定出多个参与该过程的基因，如DMRT1、SOX9、FOXL2、AMH、DAX1、WNT4和SF1，且这些基因在不同脊椎动物类群中具有进化保守性，但不同分类单元如何利用细胞信号通路形成相似的生殖结构（卵巢或睾丸）仍未完全阐明。两栖动物中，已有若干无尾类（如Xenopus laevis、X. tropicalis、Bombina bombina等）和有尾类（如Pleurodeles waltl）的基因表达研究，但关于墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）这一濒危有尾类的性腺分化相关基因表达信息仍然有限。此前对A. mexicanum早期幼虫性腺发育的形态学描述已确定了关键发育阶段，但Sox9和Vasa这两个在哺乳动物性腺发育中具有重要功能的基因在其性腺分化中的表达动态尚不清楚。因此，本研究旨在利用免疫荧光技术，表征Sox9和Vasa基因在A. mexicanum幼虫性腺分化过程中的表达特征。

研究人员以墨西哥国立自治大学生物学研究所生态恢复实验室捐赠的4窝A. mexicanum卵为材料（采集许可号FAUT-0112），在16°C±2°C、12小时光照/12小时黑暗条件下饲养，幼虫分别以Artemia franciscana、Culex stigmatosoma和Tubifex tubifex为食。按发育阶段（S50、S53、S55、S57及3月龄，每阶段n=10）收集样本，并根据Bordzilovskaya等（1989）和Nye等（2003）的分期表进行分期。对于S50和S53幼虫，取体中后部区域进行处理；S55、S57及3月龄幼虫则通过显微解剖分离性腺。主要技术方法为免疫荧光检测：样本经4%多聚甲醛固定、蔗糖包埋、冷冻切片（20 μm），分别使用抗Sox9（Abcam ab5535，1:200）、抗Vasa（Abcam ab13840-100，1:250）和抗laminin（Abcam ab11575，1:200）一抗孵育，以cy3标记二抗，最后用共聚焦显微镜（LSM 5 Pascal，Zeiss）观察。阴性对照省略一抗。层粘连蛋白（laminin）被用作基底膜标记，用以界定性腺区域。

**3.1 未分化性腺（Undifferentiated Gonads）**：在S50，性腺处于未分化阶段，呈细长、不规则且致密的结构，靠近中肾和沃尔夫管。免疫荧光显示，laminin在基底膜中表达，勾勒出性腺、中肾管和沃尔夫管的边界；Vasa蛋白在构成性腺的生殖细胞细胞质中表达；Sox9蛋白在性腺体细胞核中表达。至S53，性腺增大，体细胞数量增加，外周区部分体细胞形成立方上皮。laminin表达显示性腺分化启动，勾画出中央髓质区，并显示生殖细胞位于皮质区；Vasa仍清晰定位于生殖细胞细胞质；Sox9主要表达于性腺体细胞核，部分中肾细胞质中亦有表达。

**3.2 卵巢分化（Ovarian Differentiation）**：在S55和S57，性腺向卵巢分化，表现为明显的皮质区与内部髓质区区域化。皮质区生殖细胞数量增加，形成两至三排同心排列；髓质区含不规则体细胞并界定中央腔。免疫荧光显示，laminin在髓质区表达，证实卵巢分化途径的形态特征；Vasa在皮质区生殖细胞细胞质中表达；Sox9在围绕生殖细胞的体细胞核中表达。3月龄时，性腺已完全分化为卵巢，呈囊状并具中央腔，皮质区可见贴附于卵巢上皮的卵泡，内含减数分裂卵母细胞。laminin在每个卵泡周围的基底膜中表达；Vasa定位于卵母细胞细胞质中；Sox9表达未被检测到。

**3.3 睾丸分化（Testicular Differentiation）**：在S55和S57，睾丸分化过程中髓质区占优势，增殖并组织成睾丸索，睾丸索内含成群的生殖细胞（精原细胞）与体细胞（未来支持细胞）。laminin围绕每条睾丸索表达；Vasa在生殖细胞细胞质中清晰表达；Sox9在围绕生殖细胞的体细胞核中表达。3月龄时，性腺完全分化为睾丸，由睾丸小叶组成，每个小叶含若干精原细胞囊，囊壁由支持细胞构成。laminin在围绕每个睾丸小叶的基底膜中表达；Vasa定位于精原细胞细胞质中；Sox9在支持细胞核中表达。

在讨论部分，研究人员总结了Vasa和Sox9的表达意义。关于Vasa表达，Vasa基因在胚胎发生过程中对生殖系特化和配子发生至关重要，已被广泛用作生殖系特异性标记。在本研究中，Vasa在A. mexicanum性腺发育的不同阶段（未分化、分化起始、分化过程及分化完成后的卵巢和睾丸）均明确局限于生殖细胞细胞质中，这与无尾类如Rana rugosa和Xenopus中的观察一致。尽管有报道称A. mexicanum的母源Vasa mRNA在早期胚胎中并非生殖系特异性，而仅在生殖细胞到达性腺后变为特异，但本研究结果支持Vasa在A. mexicanum中可作为生殖系标记。关于Sox9表达，Sox9是哺乳动物睾丸分化的关键转录因子，在A. mexicanum中，Sox9在未分化性腺和分化中的两性性腺体细胞核中均有表达。在3月龄分化的卵巢中，Sox9表达缺失，表明其被下调；而在分化的睾丸中，Sox9局限于支持细胞核。这种晚期二态性表达模式与X. tropicalis、Bufo marinus及R. rugosa等物种中的观察相符，提示Sox9在A. mexicanum中可能参与性别分化而非性别决定，且与其他脊椎动物一样，存在Sox9亚型或不同表达调控机制的可能性。

最后，研究人员将研究结论总结如下：本研究的目的是确定Sox9和Vasa基因在美西螈（A. mexicanum）性腺分化过程中的表达。结果显示，这些基因编码的蛋白质在未分化性腺、性腺分化期间以及已分化性腺中的体细胞和生殖细胞中均有表达。Sox9和Vasa基因在A. mexicanum早期性腺发育中的存在表明，该物种可能保留了与哺乳动物和其他脊椎动物类似的信号通路，用于生殖系特化和性腺体细胞命运决定。这一研究为理解有尾两栖类性腺分化的分子机制提供了重要基础，并提示这些基因在脊椎动物进化中具有功能保守性。