锂掺杂羟基磷灰石纳米线（Li-nHAP）经溶酶体依赖性铁死亡轴逆转衰老巨噬细胞促进老年骨再生

《Advanced Science》：Lithium-Doped Hydroxyapatite Nanowires Rejuvenate Senescent Macrophages Via the Lysosome-Dependent Ferroptosis Axis to Promote Aged Bone Regeneration

　　

衰老性骨修复仍是重大临床挑战，尚缺乏完全令人满意的策略。新证据表明，巨噬细胞衰老是老年骨骼中骨愈合受损的关键决定因素，因此精准逆转巨噬细胞衰老已成为极具前景的治疗途径。本研究以衰老巨噬细胞的多组学特征为指导，研究人员开发了锂掺杂羟基磷灰石纳米线（Li-nHAP），并证明Li-nHAP可有效减轻巨噬细胞衰老，继而增强衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化。机制上，研究人员鉴定出溶酶体依赖性铁死亡轴是介导Li-nHAP在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中抗衰老作用的既往未识别靶点。具体而言，Li-nHAP重建溶酶体稳态，包括恢复酸性、保持膜完整性、维持铁储存和增强水解活性，从而抑制铁死亡并最终逆转巨噬细胞衰老。体内研究进一步验证，Li-nHAP在老年下颌骨缺损模型中显著减轻巨噬细胞铁死亡和衰老、减少局部铁蓄积并加速骨再生。总之，这些发现确立Li-nHAP作为一种新型骨免疫调节生物材料，为修复年龄相关骨缺损提供了有前景的策略。

全球人口快速老龄化使老年群体广泛骨创伤、骨折和骨缺损发生率升高，老年骨修复仍是重大临床挑战。既往多归因于骨髓间充质干细胞（BMSCs）功能耗竭和成骨能力下降，但免疫衰老日益被视为骨骼再生受损的关键因素。老年骨髓中巨噬细胞比例增加并呈促炎、衰老表型，通过衰老相关分泌表型（SASP）旁分泌损害BMSCs成骨和骨折愈合。现有靶向衰老巨噬细胞策略多集中于中和单个SASP因子，但SASP网络复杂且功能冗余，单因子阻断疗效可能受限。铁死亡（ferroptosis）是铁依赖、脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡，与“铁老化”相关；溶酶体是细胞铁储存和代谢中枢，其功能障碍可致铁泄漏、Fenton反应和脂质过氧化。然而，老年骨修复中巨噬细胞衰老的上游机制及溶酶体—铁死亡轴尚不清楚。基于衰老巨噬细胞多组学特征，研究人员构建Li-nHAP，旨在恢复溶酶体稳态、抑制铁死亡、逆转巨噬细胞衰老并促进老年骨再生。该研究发表于《Advanced Science》，为年龄相关骨缺损修复提供了新型骨免疫调节生物材料策略。

关键技术方法包括：对年轻与衰老骨髓来源巨噬细胞（Yg-BMDMs、Sn-BMDMs）行转录组、数据非依赖采集（DIA）蛋白质组和非靶向代谢组多组学分析，并再分析公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE280914；水热法合成0%、5%、10%锂掺杂纳米羟基磷灰石（Li-nHAP），用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、飞行时间二次离子质谱（TOF-SIMS）、电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、Brunauer–Emmett–Teller（BET）及pH依赖溶出表征；体外检测衰老、铁死亡、溶酶体功能及条件培养基（CM）成骨分化；在18月龄雄性C57BL/6小鼠下颌骨临界缺损模型中用甲基丙烯酰化明胶（GelMA）局部递送，行8/12周Micro-CT、组织学与免疫分析；并用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞及Erastin体内干预。样本来源为2月龄或18月龄雄性C57BL/6小鼠及GSE280914数据集。

研究结果如下。

2.1 Sn-BMDMs损害BMSCs成骨并呈现独特促衰老特征：通过Yg-BMDMs、Sn-BMDMs及达沙替尼和槲皮素（D&Q）处理Sn-BMDMs的CM处理年轻或衰老BMSCs，发现Sn-BMDMs CM抑制成骨，D&Q处理的Sn-BMDMs CM可逆转；多组学显示Sn-BMDMs炎症、衰老、铁死亡上调及溶酶体相关通路异常；再分析GSE280914显示老年骨折组织巨噬细胞衰老评分、SASP和铁死亡特征升高。结论为Sn-BMDMs损害BMSCs成骨并具促衰老、铁死亡和溶酶体功能障碍特征。

2.2 Li-nHAP表征：水热合成0%、5%、10% Li-nHAP，SEM/TEM显示均匀短线，TOF-SIMS显示Li分布，ICP-OES显示持续Li释放，FTIR/XRD显示晶体结构不变，BET显示介孔，酸性条件溶出增强；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）和溶血实验选择2 μg/mL，5%Li-nHAP用于后续。

2.3 Li-nHAP逆转巨噬细胞衰老并减轻SASP：转录组、逆转录定量PCR（RT-qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、磷酸化组蛋白H2AX（γ-H2AX）免疫荧光、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色及H₂O₂模型显示，Li-nHAP下调Cdkn2a、Cdkn1a、Trp53及SASP因子，减少TNF-α、MMP3、DNA损伤和SA-β-gal；5%优于10%，LiCl可模拟，nHAP作用弱；Li-nHAP抑制M1并促进M2极化。结论为Li⁺主要介导抗衰老和免疫调节。

2.4 Li-nHAP通过抑制铁死亡减轻巨噬细胞衰老：IPA和蛋白组显示Sn-BMDMs铁死亡通路激活、Li-nHAP逆转；BODIPY 581/591 C11、丙二醛（MDA）、RhoNox-6、总铁、DCFH-DA和谷胱甘肽（GSH）检测显示Li-nHAP降低脂质过氧化、Fe²⁺和活性氧（ROS），恢复GSH；Erastin取消Li-nHAP抗衰老作用，蛋白免疫印迹（Western blotting，WB）显示P21/P53下调依赖铁死亡抑制。结论为Li-nHAP经抑制铁死亡减轻巨噬细胞衰老。

2.5 Li-nHAP通过恢复溶酶体稳态减轻铁死亡：排除线粒体通路后，IPA、AUCell和通路富集聚焦溶酶体；Lyso-FerroRed显示Sn-BMDMs溶酶体铁池耗竭且胞质铁升高，吖啶橙（AO）显示膜通透性增加，DQ-BSA和组织蛋白酶B（CTSB）显示水解活性异常，LysoSensor显示酸性降低，V-ATPase亚基及ATP6V1A-LAMP1共定位下降；Li-nHAP恢复上述指标，LiCl可模拟；巴弗洛霉素A1（BafA1）和L-leucyl-L-leucine methyl ester（LLOME）取消Li-nHAP抗铁死亡作用。结论为Li-nHAP抗铁死亡依赖溶酶体稳态。

2.6 Li-nHAP经巨噬细胞旁分泌促进衰老BMSCs成骨：用Sn-BMDMs+Li-nHAP CM处理衰老BMSCs，骨桥蛋白（OPN）免疫荧光、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红S（ARS）染色及Runx2、Alpl、Spp1、Col1a1表达升高。结论为Li-nHAP处理后的巨噬细胞旁分泌环境更利于衰老BMSCs成骨分化。

2.7 Li-nHAP+GelMA促进老年小鼠临界下颌缺损修复：GelMA载nHAP或Li-nHAP保持多孔结构；老年小鼠下颌临界缺损植入后，8周Micro-CT显示Li-nHAP+GelMA提高骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th），苏木精-伊红（H&E）、Masson三色、骨钙素（OCN）、骨形态发生蛋白2（BMP2）和OPN结果支持，12周效果持续；安全性指标无明显异常。结论为Li-nHAP+GelMA有效促进老年下颌骨缺损修复。

2.8 Li-nHAP+GelMA改善老年下颌缺损巨噬细胞铁死亡和衰老：F4/80与P21、γ-H2AX、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）双标及普鲁士蓝显示，Li-nHAP+GelMA减轻巨噬细胞衰老、DNA损伤、铁死亡和铁沉积；氯膦酸脂质体清除巨噬细胞削弱其成骨效应，Erastin体内激活铁死亡削弱修复。结论为其再生优势部分依赖巨噬细胞，且关键与抑制过度铁死亡相关。

讨论部分总结：原文指出，巨噬细胞清除和药理激活铁死亡虽提供体内功能证据，但未直接建立巨噬细胞特异性遗传因果；局部递送锂对T淋巴细胞、内皮细胞和破骨细胞等其他骨免疫微环境组分的作用尚待明确；未来可采用巨噬细胞特异性遗传操控铁死亡调控因子。研究仅选雄性小鼠以避免性别二态性影响，未来需在老年雌性动物中评估性别差异；局部Li⁺浓度未在体内直接测定，未来应评估局部和系统Li⁺水平。

研究结论部分翻译：巨噬细胞衰老是老年骨骼骨再生受损的关键决定因素。本研究以Sn-BMDMs中溶酶体功能障碍和铁死亡失调的多组学证据为指导，构建Li-nHAP以对抗该表型。体内实验证明，Li-nHAP有效逆转Sn-BMDMs并促进衰老BMSCs成骨分化。机制上，Li-nHAP持续释放Li⁺，重建溶酶体稳态，包括恢复酸性、保持膜完整性、维持铁储存和增强水解活性，从而阻断铁死亡并减轻巨噬细胞衰老。在老年小鼠下颌骨缺损模型中，Li-nHAP+GelMA显著减少铁过载、抑制巨噬细胞衰老和铁死亡，并实现优越的体内骨再生。研究人员将溶酶体铁稳态失衡鉴定为老年骨修复中Sn-BMDMs的铁死亡相关特征，并证明局部递送Li-nHAP可重编程该巨噬细胞状态以促进老年小鼠下颌骨再生。