基于单克隆抗体的HIV整合酶链转移抑制剂比克替拉韦、卡博特韦与多替拉韦高灵敏度快速侧向层析检测方法研究

《AIDS Research and Treatment》：A Highly Sensitive and Specific Rapid Lateral Flow Assay for the HIV Integrase Strand Transfer Inhibitors Bictegravir, Cabotegravir, and Dolutegravir

　　

背景：第二代HIV-1整合酶链转移抑制剂（integrase strand transfer inhibitors，INSTIs）——比克替拉韦（bictegravir，BIC）、卡博特韦（cabotegravir，CAB）和多替拉韦（dolutegravir，DTG）——是高效力抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy，ART）的核心组分，CAB亦被用于长效化学预防。临床相关INSTI浓度的快速检测可为即时检测评估和实时临床决策提供支持。研究人员开发了一种可检测全血和血浆中BIC、CAB和DTG的侧向层析检测法（lateral flow assay，LFA），并依据预设浓度阈值及高效液相色谱-串联质谱法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）对其性能进行了评估。 方法：研究人员采用单克隆抗体设计了一种统一的LFA检测卡，可区分BIC、CAB和DTG浓度低于谷浓度、处于最低至中度谷浓度以及达到理想浓度三种情况。LFA结果在20分钟时进行目视判读，并与124份临床血浆标本经LC-MS/MS定量的INSTI浓度进行比较。 结果：在24份来自美国接受含上述三种INSTI之一治疗方案参与者的血浆样本中，除1份DTG标本外，LFA判读结果与所有LC-MS/MS结果一致；该份DTG标本经LFA判读为1.0–1.6 μg/mL，而LC-MS/MS测定值为2.1 μg/mL。在来自斯威士兰常规国家监测的100份血浆剩余样本中，LFA正确判读了95份标本的DTG浓度。4份标本的DTG LC-MS/MS浓度略高于LFA判定范围，差异≤0.1 μg/mL；另有1份经LC-MS/MS测定为1.20 μg/mL的标本被LFA判读为≥1.6 μg/mL。总计124份标本中有6份（4.8%）的LFA判读INSTI浓度与LC-MS/MS结果存在轻微差异，经Wilcoxon符号秩检验（W=8.00，p=0.94，单尾）显示总体性能无统计学显著差异。 结论：该LFA设计成功提供了具有临床实用价值的BIC、CAB和DTG浓度判读，<5%的样本存在轻微偏差。重要的是，所有浓度<1 μg/mL的低浓度样本均被LFA正确判读。该检测法作为评估临床相关INSTI浓度的即时检测工具展现出良好前景。

论文解读：基于竞争性侧向层析免疫检测法的HIV整合酶链转移抑制剂快速浓度评估研究

一、研究背景与问题

第二代HIV-1整合酶链转移抑制剂（INSTIs）——比克替拉韦（BIC）、卡博特韦（CAB）和多替拉韦（DTG）——凭借高基因耐药屏障、有限的药物相互作用、优异的病毒学抑制率和良好的耐受性，已成为HIV抗逆转录病毒治疗（ART）的标准方案。此外，长效制剂用于治疗和暴露前预防（PrEP）可减少给药频率并提供持续保护，有助于克服依从性问题。对这些第二代INSTIs进行药理学监测可客观评估ART和PrEP使用者的抗病毒药物浓度。然而，当HIV诊断检测出现结果不一致时，在血液样本中鉴定INSTIs可提供证据表明抗逆转录病毒药物可能将HIV诊断靶标抑制至导致检测结果不一致的水平。

当前存在的核心问题包括：BIC每日口服50 mg的平均血浆峰浓度（C_max）为6.5 μg/mL（范围4.40–9.61 μg/mL），平均谷浓度为2.32 μg/mL（1.44–3.76 μg/mL）；CAB每日口服30 mg在连续给药28天时的中位血浆浓度为5.98 μg/mL（范围2.19–8.78 μg/mL）；DTG每日口服治疗在24小时的平均治疗浓度（C₂₄）为1.32 μg/mL（范围1.18–1.47 μg/mL）。长效CAB（CAB-LA）用于PrEP时每8周肌内注射600 mg，中位血浆浓度为3.79 μg/mL，理想中位谷浓度为1.58 μg/mL（1.39–1.80 μg/mL），约为保护性浓度基准——4倍蛋白校正IC₉₀（PA-IC₉₀）即0.66 μg/mL的两倍多。纵向CAB-LA注射存在显著的个体内药代动力学变异性，谷浓度可降至4倍PA-IC₉₀浓度附近。

传统药物浓度检测依赖高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），该方法准确但需要专业实验室设备和操作人员，无法在资源有限环境或即时检测场景中广泛应用。因此，开发一种快速、低成本、可在护理点使用的INSTI浓度评估工具具有重要临床意义。

二、研究目的与总体设计

研究人员开发了一种竞争性侧向层析检测法（LFA），命名为"InTest-Rapid"，旨在评估接受治疗或长效PrEP（LA-PrEP）人群新鲜全血或血浆中BIC、CAB和DTG的治疗性或保护性浓度。免疫层析LFA基于抗原-抗体相互作用原理运行，生产成本低、检测快速，可在多种医疗场景或作为非处方产品使用。由于INSTI分子较小只能容纳单个抗体结合，药物检测需采用竞争性格式：样本中的INSTI与标记的单克隆抗体（mAb）结合后，减少了抗体与检测线上预制的INSTI模拟物结合的能力。因此，与常规诊断LFA中检测线出现不同，足够的INSTI浓度导致检测线消失。

该LFA设计包含两条检测线，由基于三种目标INSTI核心结构合成的整合酶抑制剂分子（INI）以不同浓度喷制而成。抗体的高亲和力针对血浆蛋白中未结合的<1%的游离INSTI，无需解离蛋白结合步骤。通过经验性测试确定了如下检测线判读模式：两条检测线均保留表示INSTI浓度低于预期谷浓度；仅上检测线消失表示浓度处于谷浓度水平；两条检测线均消失表示浓度达到或超过目标（理想）浓度。

三、关键技术方法

研究人员采用以下主要技术方法开展研究：一是单克隆抗体开发与筛选，将INI分子与免疫原性载体蛋白Limulus Polyphemus Hemocyanin II偶联后免疫五只Balb/c小鼠，经100天免疫后生成80个杂交瘤，通过竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选出对BIC、CAB和DTG具有最佳灵敏度和特异性的克隆，最终选定mAb Clone 24（3H9E4）；二是竞争性侧向层析检测卡设计，采用卡式层压条设计，包含样本垫、金纳米颗粒标记抗体结合垫、含检测线和质控线的硝酸纤维素膜及吸收垫；三是临床样本验证，采用来自美国接受BIC、CAB或DTG治疗方案的24份血浆样本（经Emory机构审查委员会批准）和来自斯威士兰HIV影响测量调查（SHIMS-3）的100份血浆剩余样本（经哥伦比亚大学、Westat公司和斯威士兰健康与人类研究审查委员会批准），以LC-MS/MS定量结果为金标准进行盲法比较。

四、研究结果

4.1 抗INI抗体检测限确定：在10个对INI模拟INSTI化合物有反应的克隆中，选定mAb Clone 24（3H9E4），该抗体对三种INSTI均表现出相似的高灵敏度和斜率线性。ELISA竞争性测试显示BIC和CAB的线性检测范围为500000 pg/mL–50 pg/mL（R2分别为0.938和0.961），DTG的线性范围为50000 pg/mL–5 pg/mL（R2=0.965）。纯化mAb 24可重复区分的最低检测限为BIC和CAB 50 pg/mL、DTG 5 pg/mL。

4.2 抗INI mAb特异性测试：将mAb 24对非靶标化合物（胆固醇、孕酮、睾酮、雌二醇、醛固酮等天然多环化合物，以及依法韦仑、奈韦拉平、利匹韦林、恩曲他滨、替诺福韦、达芦那韦、依曲韦林、洛匹那韦、利托那韦等抗逆转录病毒药物）的反应性与BIC结合进行比较。每种化合物以1.75 μg/mL浓度在正常人血浆中稀释，通过光密度（OD）降低评估抗体反应性。所有非靶标化合物的OD比值均<1.5，表明无显著交叉反应。

4.3 LFA检测线判读标准建立：通过反复经验性测试定量INSTI稀释液，确定下检测线喷制16 ng、上检测线喷制9 ng INI抗原可获得目标性能。最终判读标准为：BIC和CAB检测中，两条检测线均清晰可见表示浓度<0.8 μg/mL；仅下检测线清晰可见表示浓度≥0.8 μg/mL至<1.3 μg/mL；无检测线可见表示浓度≥1.3 μg/mL。DTG检测中，两条检测线可见表示浓度<1.0 μg/mL；一条检测线可见表示浓度≥1.0至<1.6 μg/mL；无检测线可见表示浓度≥1.6 μg/mL。任何情况下若质控线缺失或任何检测线不完整，则判为无效。

4.4 临床样本盲法检测性能：在124份临床样本中，118份（95.2%）的LFA判读与LC-MS/MS定量结果范围一致。5份样本（1份来自美国，4份来自斯威士兰）的LFA判读略低于LC-MS/MS浓度但差异在0.1 μg/mL以内；1份斯威士兰样本的LFA判读（≥1.6 μg/mL）高于LC-MS/MS定量值（1.2 μg/mL）。总计4.8%的标本存在轻微判读差异。Wilcoxon符号秩检验（W=8.00，p=0.94，单尾）显示LFA总体性能与LC-MS/MS无统计学显著差异。所有LC-MS/MS测定为低于预期谷浓度的样本均被LFA正确判读，未出现将低浓度错误判读为高浓度的情况。

五、讨论与结论

该LFA采用自研mAb成功实现了对BIC、CAB和DTG临床相关浓度的灵敏、快速检测。抗体Clone 24对INSTIs具有皮克/毫升级灵敏度，可直接用于血液检测而无需蛋白解离步骤，这一特性源于INSTIs高度蛋白结合背景下高灵敏度抗体仅靶向<1%游离药物的设计优势。由于mAb对DTG的灵敏度高于BIC和CAB，单一检测卡设计中DTG检测需增加稀释步骤。两条检测线系统提供了围绕临床相关浓度的额外保障，尤其对接近谷浓度下限的关键浓度区间，低浓度样本可通过两条检测线均保留被正确识别。对于CAB-LA PrEP监测，检测线从消失到出现的转变可预示CAB药代动力学随时间下降的趋势。

该检测法在公共卫生系统HIV检测中具有多重应用场景：解决HIV诊断检测结果不明确时抗逆转录病毒药物干扰的快速评估；临床试验参与者依从性评估；治疗依从性流行率的监测指标；LA-PrEP就诊间期自我检测以确保保护性浓度维持；以及在病毒血症患者中快速评估药物水平以优先安排基因型耐药检测。

研究存在一定局限性：临床测试主要基于血浆样本，新鲜全血的临床测试仍在进行中；部分个体LFA检测结果持续低于LC-MS/MS定量值，差异较小但原因未明；所有差异均见于DTG检测，稀释步骤可能引入误差；LC-MS/MS本身存在高达15%的准确性误差，可能影响处于判读阈值边界浓度的定量；LFA判读由经验丰富的检测人员完成，竞争性检测中检测线消失的判读方式与传统检测中检测线出现的判读方式相反，可能需要学习期。

研究结论：INSTI快速LFA（InTest-Rapid）在解读血浆样本中BIC、CAB和DTG临床显著浓度方面表现可接受。约5%检测结果的轻微差异未导致LFA与金标准LC-MS/MS浓度之间的严重不一致，对总体检测性能无显著影响。建立全血和血浆双重适用参数使该检测可在多种场景灵活应用。快速获取抗逆转录病毒药物浓度用于治疗和生物医学预防的实时临床管理，有助于优化患者护理；在临床研究和诊断疑难病例中便捷获取抗逆转录病毒药物使用的生物学证据，可避免基于未识别药物使用影响结果的临床判读，将抗逆转录病毒药物使用的客观生物学证据纳入研究方案和临床评估将提高诊断准确性和研究结论可靠性。