生物活性羧甲基纤维素（CMC）/角蛋白/富血小板纤维蛋白（PRF）复合支架的构建及其牙周组织再生潜力评价

《BioMed Research International》：Development of a Bioactive Carboxymethyl Cellulose (CMC)/Keratin/Platelet-Rich Fibrin (PRF) Composite Scaffold for Periodontal Regeneration

　　

牙周炎（periodontitis）是一种慢性炎症性疾病，可导致锚定牙齿的结构逐渐破坏，在晚期构成显著临床问题。牙周组织工程已被提出作为一种有效的再生策略，将生物材料支架与生物活性因子结合以恢复受损组织。本研究开发并评价了一种用于牙周组织再生的新型羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）/角蛋白/富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）复合支架。通过冷冻干燥制备不同重量比的多孔CMC/角蛋白支架，并使用戊二醛（glutaraldehyde，GLU）进行化学交联。在结构和力学评估后，选择优化的CMC/角蛋白配方（40/60），随后掺入PRF以改善生物学性能。对所得支架进行化学组成（傅里叶变换红外光谱，FTIR）、形貌（扫描电子显微镜，SEM）、力学行为、细胞相容性（MTT法）以及使用L929成纤维细胞的细胞黏附评价。FTIR光谱提示复合支架内CMC、角蛋白和PRF之间存在分子间相互作用。SEM分析显示优化支架具有高度互连的多孔结构，且在PRF掺入后得以保留。PRF掺入改善了支架的力学性能，表现为拉伸强度、弹性模量和韧性增加，而断裂伸长率几乎不变。体外细胞相容性实验表明所有支架均无细胞毒性，其中MTT法测定显示CMC/角蛋白/PRF复合支架的细胞活力显著高于CMC/角蛋白支架。定性SEM观察也提示含PRF复合支架上细胞附着和铺展增强。总体而言，研究结果表明CMC、角蛋白和PRF的协同整合产生了具有合适结构、力学和生物学特性的生物活性支架。CMC/角蛋白/PRF复合支架在牙周组织工程中显示出合适潜力；然而，未来需要涉及牙周特异性细胞和体内模型的研究以进一步验证其临床适用性。

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，可导致牙龈、牙周膜（periodontal ligament，PDL）、牙骨质和牙槽骨等牙周支持组织逐渐破坏，若未控制可引起牙齿松动乃至脱落。其发病机制涉及致病生物膜与失调宿主免疫反应之间的复杂相互作用，并受糖尿病、吸烟等全身和环境因素影响。尽管牙周治疗和疾病分类不断改进，晚期丧失牙周组织的可预测再生仍是临床难题。标准洁治和根面平整在早期可控制炎症、延缓疾病进展，但广泛组织丧失时需再生手术以恢复牙周结构和功能。传统骨移植和引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR）膜具有临床疗效，但存在自体移植物来源有限、供区并发症、感染或免疫反应风险及长期结果不一致等限制。因此，牙周组织工程作为可预测再生的替代策略受到关注。支架通过构建三维微环境促进细胞黏附、增殖、迁移和分化；与被动屏障膜不同，生物活性支架可主动影响细胞活动，并通过模拟天然细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的生化组成和结构促进再生。CMC具有生物相容性、可降解性、亲水性和易加工性，但纯CMC生物活性和细胞黏附性有限、力学稳定性较差，需与生物活性聚合物复合。角蛋白具有良好生物相容性、可降解性、低免疫原性和内在生物活性，并含RGD、LDV、EDS等细胞结合基序；PRF为自体血源材料，由富含血小板、白细胞及生长因子的纤维蛋白基质组成，可促进血管生成、细胞增殖和组织修复。基于此，研究人员构建CMC/角蛋白/PRF复合支架，假设CMC作为结构基质、角蛋白作为模拟ECM的生物活性组分、PRF作为内源性生长因子来源，可协同改善支架理化、力学和生物学性能，并系统评价其用于牙周组织工程的适用性。

关键技术与方法：研究人员采用冷冻干燥制备不同CMC/角蛋白质量比（95/5、90/10、80/20、40/60）的多孔支架，以GLU化学交联并充分洗涤；根据结构与力学结果筛选40/60配方，再掺入10%（w/w）冻干PRF制备复合支架。PRF来源于单一健康、不吸烟的45岁男性志愿者（无系统性疾病及近1个月用药史），经机构研究伦理委员会批准并获书面知情同意，按Choukroun方案制备。评价包括FTIR、SEM、单轴拉伸力学测试、L929小鼠成纤维细胞提取物MTT法及SEM细胞黏附与形态观察。

研究结果如下。3.1 支架表征（Scaffolds Characterization）：通过FTIR和SEM研究化学结构、分子间相互作用及形貌。FTIR显示冻干PRF具有蛋白特征吸收带，约1636 cm^?1为酰胺I带（C=O伸缩），约1540 cm^?1为酰胺II带（N–H弯曲和C–N伸缩），约1238 cm^?1为酰胺III振动；CMC/角蛋白支架显示约1056 cm^?1的CMC多糖骨架C–O–C伸缩和约1440 cm^?1的羧酸根（COO^?）对称伸缩，并出现酰胺I和酰胺II带。CMC/角蛋白/PRF复合支架中约1636 cm^?1酰胺I带仍可检测但强度降低，约933 cm^?1新吸收带提示CMC、角蛋白和PRF之间形成交联网络。SEM显示冻干PRF粉末呈不规则纤维状；低角蛋白含量（95/5和80/20）支架孔结构较不均、互连性有限且孔壁较薄脆弱；40/60支架孔结构视觉上更互连、分布更均匀，故被选为优化配方；掺入PRF未明显改变多孔结构，但表面稍粗糙。3.2 力学性能（Mechanical Properties）：通过单轴拉伸应力–应变分析（n=5独立支架）发现，PRF掺入使拉伸强度由0.10 ± 0.02 MPa提高至0.13 ± 0.01 MPa，弹性模量由0.60 ± 0.04 MPa提高至0.76 ± 0.03 MPa，断裂伸长率均约0.5%，韧性由0.0372 ± 0.002 MJ/m³提高至0.0488 ± 0.001 MJ/m³，表明含PRF支架在断裂前吸收机械能的能力增强。3.3 细胞毒性与形态评价（Cytotoxicity and Morphology Assessments）：通过L929成纤维细胞提取物MTT法和SEM观察。MTT法显示培养3天时所有支架组细胞活力与对照相当或更高，无细胞毒性，CMC/角蛋白/PRF复合支架细胞活力最高；培养7天时所有支架组细胞代谢活性显著增加，CMC/角蛋白/PRF支架仍显著高于CMC/角蛋白支架和对照组，PRF单独组细胞活力亦随时间增加。SEM观察48 h后，CMC/角蛋白支架上细胞可黏附但多呈圆形或略伸长，铺展有限、胞质突起较少；CMC/角蛋白/PRF复合支架上细胞呈良好铺展的纺锤形，具有广泛胞质突起，并可桥接孔隙、与支架基质密切互动；上述细胞黏附和形态结果为定性观察，未进行定量评价。

讨论部分总结：宏观观察确认冷冻干燥后支架自支撑且结构稳定，PRF掺入未损害大体形貌；FTIR表明各组分主要化学结构得到保留，CMC的羟基/羧基与角蛋白氨基之间可能存在氢键，GLU可能与蛋白氨基形成Schiff碱（C=N）连接，约933 cm^?1带提示更完整的交联网络，约2361 cm^?1弱带更可能来自FTIR测量中环境CO₂吸收，约3200 cm^?1宽峰与O–H和N–H伸缩重叠有关；SEM提示角蛋白含量影响微结构，40/60支架结构组织更佳，PRF保持多孔网络并增加表面粗糙度，可能提供额外拓扑信号并促进蛋白吸附，但孔尺寸、孔隙率和互连性仅基于SEM主观评价，未定量，未来可用图像分析或微型计算机断层扫描（micro-computed tomography，micro-CT）进一步表征；力学改善可能归因于PRF的纤维蛋白网络和蛋白组分增强支架结构并促进应力传递，韧性提高有利于承受生理机械应力；MTT结果支持细胞相容性，角蛋白细胞结合基序与PRF中PDGF、TGF-β、VEGF等生物活性蛋白和生长因子可能共同促进细胞反应，但本研究未直接测定生长因子释放，相关作用系依据既往文献推断；SEM定性提示PRF改善细胞黏附和铺展，但未进行细胞计数、铺展面积或形态计量分析；总体而言，CMC/角蛋白/PRF复合支架兼具结构完整性、力学性能和生物活性，相较既往CMC或角蛋白支架，PRF引入提供内源性生长因子相关的额外生物学优势，但仍需牙周特异性细胞和体内模型验证。研究结论翻译：本研究成功制备了由CMC、角蛋白和PRF组成的生物活性复合支架，并针对牙周组织工程应用进行了系统表征。将角蛋白掺入CMC基质显著改善了支架形态和力学性能，其中CMC/角蛋白（40/60）配方在强度与孔隙率之间表现出最有利的平衡。随后加入PRF进一步增强了支架的生物学性能，同时未损害其结构完整性。MTT法测定显示，CMC/角蛋白/PRF复合支架具有优异细胞相容性，并较不含PRF的支架促进更高细胞活力。定性SEM观察也提示含PRF复合支架上细胞黏附和铺展改善。这些改善可能与角蛋白中生物活性细胞结合基序的存在以及PRF已被充分记录的生物活性有关。然而，本研究未直接研究生长因子释放，未来工作应对此进行评价。尽管当前研究仅限于使用成纤维细胞模型的体外评价，所得结果突显了CMC/角蛋白/PRF支架作为牙周组织工程生物活性平台的潜力。未来研究应关注其在牙周特异性细胞类型和体内模型中的性能，以进一步评估其临床适用性和再生疗效。