APS–Exos@GelMA水凝胶局部递送黄芪多糖与人脐带间充质干细胞外泌体促进全层皮肤创面愈合

《Chronic Diseases and Translational Medicine》：GelMA-Based Hydrogel Encapsulating Astragalus Polysaccharides and Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell Exosomes Promotes Full-Thickness Skin Wound Healing

背景：创面愈合涉及过度氧化应激和细胞功能障碍，而现有单一疗法仍不充分。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides, APS）和外泌体（exosomes, Exos）具有抗氧化和再生特性，明胶甲基丙烯酰基（gelatin methacryloyl, GelMA）水凝胶提供生物相容性局部递送平台。在此，研究人员开发了APS–Exos@GelMA水凝胶以促进创面修复。方法：通过体外细胞实验评估APS和Exos的生物学效应，同时表征APS–Exos@GelMA的理化性质和生物相容性。通过宏观观察和组织学分析在全层皮肤缺损模型中进一步评估其治疗效能。结果：与单用APS或Exos相比，APS–Exos处理显示出增强效应，提高成纤维细胞活力（130.90% ± 2.98%，p < 0.05）和角质形成细胞活力（124.50% ± 3.18%，p < 0.01），促进成纤维细胞迁移（74.15% ± 7.72%），并降低氧化损伤（72.11% ± 2.13%）。APS–Exos@GelMA保持良好水凝胶特性和生物相容性，同时实现APS和Exos的局部负载和应用。体内，APS–Exos@GelMA加速创面闭合，促进表皮重建和细胞外基质沉积，并表现出良好生物安全性。结论：在适当浓度范围内，APS与Exos联合显示出优于单一治疗的改善治疗潜力。APS–Exos@GelMA水凝胶作为生物相容性局部递送平台促进组织修复，突显其在创面愈合应用中的潜力。

研究背景与意义：皮肤是抵御外界环境损伤的重要屏障，损伤后经历止血、炎症、增殖和重塑等高度协调的愈合过程。糖尿病、血管疾病或感染等因素可导致创面无法按正常时程愈合，如糖尿病足溃疡和压力性溃疡，其典型特征为氧化应激失衡和细胞功能受损，导致创面微环境失调、无法进入有效组织修复，严重降低患者生活质量并增加医疗负担。因此，调节创面微环境、恢复细胞功能并促进组织再生是慢性创面管理的关键问题。APS作为黄芪主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化和促血管生成作用，并可增强成纤维细胞功能；HUCMSC-Exos为30–150 nm的纳米囊泡，携带蛋白质、脂质和microRNA，可促进细胞增殖与迁移、调节氧化应激反应并促进组织再生，但其体内快速扩散和降解导致创面滞留差、生物利用度低。现有递送系统中，天然聚合物水凝胶机械性能较弱且溶胀过度，合成水凝胶可调但缺乏天然ECM生物信号；GelMA保留RGD序列和基质金属蛋白酶敏感位点，可光交联形成ECM样三维网络，具良好生物相容性、可控降解性和可调机械性能。基于此，研究人员构建负载HUCMSC-Exos和APS的GelMA基复合水凝胶，以实现联合局部递送，改善创面微环境、细胞功能、氧化应激和组织再生，并通过体外细胞实验和体内创面模型系统评价其疗效。研究结论表明APS与Exos在适当浓度范围内联合较单用具有改善的治疗潜力，APS–Exos@GelMA作为生物相容性局部递送平台促进组织修复，为创面修复的先进生物材料策略提供依据。

关键方法：方法上，研究人员使用 passages 3–5 HUCMSCs（购自BioAngle (Xiamen) Technology Co., Ltd.）经形态、流式表面标志物及三系分化鉴定；以差速超速离心分离HUCMSC-Exos，经NTA、TEM和Western blot表征，PKH67标记评估HaCaT与L929摄取。用CCK-8筛选APS/Exos浓度，划痕实验测迁移，DCFH-DA测ROS，H₂O₂诱导HaCaT氧化应激并用Calcein-AM染色。制备光交联GelMA及APS@GelMA、Exos@GelMA、APS–Exos@GelMA，表征SEM、溶胀、降解、外泌体释放、溶血和Live/Dead细胞相容性。采用SPF级雄性C57BL/6J小鼠（购自江苏集萃药康）建立全层皮肤缺损模型，设PBS、GelMA、Exos@GelMA、APS–Exos@GelMA组（n=6），第0、7、12天评估闭合，第12天行H&E、Masson和主要器官H&E；HaCaT与L929购自ATCC。

研究结果：
3.1 HUCMSC Identification：通过倒置显微镜、流式细胞术和三系分化染色，发现passages 3–5 HUCMSCs呈贴壁短梭形或成纤维细胞样，CD73、CD90、CD105高表达（≥95%），CD34、CD45、HLA-DR、CD19、CD11b低表达（≤2%），并具软骨、脂肪和成骨分化能力，结论为细胞符合HUCMSCs特征并适合后续外泌体分离。
3.2 HUCMSC-Exos Characterization：通过Western blot、TEM、NTA和PKH67摄取实验，发现CD9、CD81、TSG101强表达而Calnexin未检出，囊泡呈典型杯状，粒径主要分布于30–150 nm、平均约130.4 nm，HaCaT 6 h和L929 24 h可见摄取荧光，结论为外泌体分离成功、纯度较高并可被皮肤相关细胞摄取。
3.3 Effects of APS and HUCMSC-Exos on L929：通过CCK-8、划痕和DCFH-DA实验，发现0–200 μg/mL APS无细胞毒性并选75 μg/mL，10–40 μg/mL Exos提高L929活力；APS–Exos（10 μg/mL）使活力达130.90% ± 2.98%且优于APS（p < 0.05），20 μg/mL未进一步增强；APS–Exos迁移率为74.15% ± 7.72%，高于APS组47.66% ± 2.61%、Exos组39.71% ± 2.39%和对照组15.82% ± 2.54%；APS–Exos较单用降低Rosup诱导的ROS，结论为联合增强成纤维细胞活力、迁移和氧化应激调节。
3.4 Effects of APS and HUCMSC-Exos on HaCaT：通过CCK-8和Calcein-AM染色，发现75 μg/mL APS提高HaCaT活力（p > 0.05）且无毒性，APS–Exos使活力达124.50% ± 3.18%，高于单用（p < 0.01）；H₂O₂组活力降至31.79% ± 3.79%，APS–Exos预处理后达72.11% ± 2.13%（p < 0.05）并改善细胞形态，结论为联合部分缓解氧化应激损伤并改善角质形成细胞反应。
3.5 Structural Characteristics and Biocompatibility of Composite GelMA Hydrogels：通过光交联、SEM、溶胀、降解、释放、溶血和Live/Dead染色，发现GelMA于405 nm UV 30 s成胶并具组织黏附，各组均呈连通多孔网络，孔径无显著差异（GelMA 47.30 ± 5.88 μm；APS@GelMA 43.33 ± 4.27 μm；Exos@GelMA 51.84 ± 1.57 μm；APS–Exos@GelMA 47.60 ± 6.71 μm），24 h达溶胀平衡，PBS中降解较慢而II型胶原酶中加速，APS–Exos@GelMA呈外泌体缓释，溶血率<5%，共培养未见明显死细胞，结论为负载不影响基本理化性质并具良好血液和细胞相容性。
3.6 In Vivo Wound-Healing Evaluation：通过小鼠全层皮肤缺损模型、宏观拍照、H&E、Masson和主要器官H&E，发现APS–Exos@GelMA加速闭合，第7天闭合率89.89% ± 3.17%，显著优于PBS（p < 0.0001）；第12天接近完全愈合，PBS、GelMA、Exos@GelMA分别为88.63% ± 2.96%、91.17% ± 2.55%、97.22% ± 2.40%；APS–Exos@GelMA表皮连续、分层清晰且胶原沉积更丰富，主要器官未见明显炎症浸润、坏死或病理异常，结论为促进表皮重建和ECM沉积并具良好体内生物安全性。

讨论总结：讨论指出慢性难愈创面以氧化应激失衡和细胞功能受损为特征，治疗策略正由单一模式转向多组分综合治疗。GelMA保留细胞相容性，其三维多孔网络支持细胞迁移和组织再生，并可通过物理包封实现生物活性分子缓释；本研究中复合水凝胶呈环境依赖降解，PBS中较慢、II型胶原酶中加速，体内虽未直接表征降解动力学，但体内结果间接支持其降解行为与组织再生过程相兼容且不阻碍修复。APS具抗炎、抗氧化和免疫调节作用，可增强L929和HaCaT活力与迁移、部分减轻氧化应激损伤；Exos含蛋白质、RNA和信号分子，可被细胞内化，调节增殖、迁移和抗氧化。两者联合的改善效果可能源于互补生物活性及部分不同信号通路，如APS经PI3K/Akt促血管生成，Exos经多通路并递送功能分子促血管生成；APS经TLR4/NF-κB抑制纤维化，Exos调节基因表达抑制过度纤维化，从而在促修复与防过度纤维化间形成动态平衡。局限包括APS在水凝胶中的释放行为未系统评价、APS提取加工及分子量差异影响药理活性而需标准化来源和方案、外泌体加工分离影响活性、剂量仍需优化，且APS与外泌体联合对炎症调控的增强或互补机制尚不清楚，需分析炎症因子、巨噬细胞极化及多组学并结合临床相关愈合受损模型进一步阐明。
研究结论（翻译）：总之，本研究提出了一种负载APS和外泌体的多功能GelMA基治疗平台，用于增强创面修复。GelMA提供有利的递送基质，APS和外泌体贡献生物学活性，包括减轻氧化应激、调节细胞行为和组织再生。通过整合局部递送与多种生物活性成分，该策略为应对传统单组分疗法的局限提供了潜在途径，并为组织工程应用的多功能生物材料开发提供了新见解。