《Radiotherapy and Oncology》：IAP inhibition enhances response to radiotherapy and chemotherapy in preclinical models of rectal cancer
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局部晚期直肠癌（LARC）的现代管理涉及序贯放疗和化疗，即全新辅助治疗（TNT）。尽管TNT显著改善肿瘤退缩并实现约30%的完全缓解率，但疗效仍部分受限于肿瘤固有的凋亡抵抗。因此，研究人员试图探究放疗对直肠癌中TNFα相关凋亡信号的影响，并评估凋亡抑制蛋白（I
局部晚期直肠癌（LARC）的现代管理涉及序贯放疗和化疗，即全新辅助治疗（TNT）。尽管TNT显著改善肿瘤退缩并实现约30%的完全缓解率，但疗效仍部分受限于肿瘤固有的凋亡抵抗。因此，研究人员试图探究放疗对直肠癌中TNFα相关凋亡信号的影响，并评估凋亡抑制蛋白（IAPs）抑制能否增强治疗应答。
研究人员对42例直肠肿瘤活检样本（新辅助放疗前及放疗两周后）进行转录组学分析，采用基因集富集分析（GSEA）鉴定放疗后改变的信号通路。在直肠癌模型中评估临床相关IAP拮抗剂tol inapant对cIAP1/2降解、放疗及化疗诱导凋亡以及5-氟尿嘧啶（5FU）诱导的药物耐受持久细胞（DTP）形成的影响。在TNFα存在下开展机制研究，并在SW837异种移植模型中评估体内疗效。
放疗诱导TNFα/TNFR1信号及凋亡相关基因集的显著上调。GSEA证实“经NFκB的TNFα信号”和“凋亡”两条通路均富集。观察到TNF、TNFRSF1A、RIPK1、TRADD和CFLAR（FLIP）上调，同时DIABLO下调，提示放疗为肿瘤发生TNFα介导凋亡做好准备，但升高的抗凋亡信号可能抑制该应答。Tol inapant降解cIAP1/2并显著增强直肠癌模型中放疗诱导的凋亡。与TNFα共处理通过caspase-8依赖性机制进一步放大凋亡。Tol inapant联合放疗在体内耐受良好，与单纯放疗相比降低了SW837异种移植瘤体积；然而该差异未达到统计学显著性。Tol inapant还增强化疗诱导的凋亡并阻止5FU诱导的DTP直肠癌细胞出现。
上述发现将TNFα相关凋亡信号确定为直肠癌潜在的放疗诱导脆弱性，并为放疗联合IAP拮抗剂提供了机制依据。Tol inapant在增强化疗诱导凋亡的同时抑制药物耐受持久细胞，支持进一步研究IAP拮抗作为改善直肠癌新辅助管理中TNT疗效的策略。
论文解读
一、研究背景与问题
直肠癌约占结直肠癌（CRC）的三分之一，位于距肛缘12–15 cm范围内。直至20世纪90年代，直肠癌局部复发率高达25–50%，主要源于盆腔解剖限制下难以获得清晰切缘。全直肠系膜切除（TME）和新辅助放疗等外科实践的改进已将局部复发率降至10%以下。新辅助放疗的两种常用方案包括短程放疗（SCRT，每日5 Gy共5天）和长程放化疗（LCCRT，同步5-氟尿嘧啶或卡培他滨联合50 Gy分28次照射）。
近年来研究聚焦两大临床问题：一是通过增强新辅助治疗效果实现最大肿瘤降期、提高非手术管理的可能性；二是降低影响25–30%患者且多数致死的远处转移风险。由此形成了局部晚期直肠癌（LARC）的新标准治疗——全新辅助治疗（TNT），即将系统化疗前移至新辅助阶段，包括SCRT或LCCRT联合FOLFOX、CAPOX或FOLFIRINOX等化疗方案。多项关键试验已证实TNT可提高病理完全缓解率、增加非手术管理率并减少远处转移。
然而TNT并非惠及所有患者。即便采用现代方案，临床完全缓解率仅为15–40%，多数患者仍不符合器官保留策略条件。相当比例的直肠癌幸存者面临持久的治疗相关毒性，如肠道功能障碍（低位前切除综合征）、化疗诱导神经病变、放射性直肠炎及盆腔骨损伤。此外，10–30%的LARC患者TNT后仍发生远处复发。因此亟需提高肿瘤应答深度和持久性、同时最小化毒性并改善生存的策略。
一个有前景的方向是增强治疗诱导的细胞死亡（凋亡）。包括结肠癌和直肠癌在内的许多癌症通过过表达凋亡抑制蛋白（IAPs）——尤其是cIAP1、cIAP2和XIAP——表现出凋亡失调。XIAP直接结合并抑制caspase-3、?7和?9，阻断凋亡执行；cIAP1和cIAP2则调控TNFα驱动的存活信号并通过RIPK1/3抑制坏死性凋亡。研究团队此前已证明，接受基于5FU辅助化疗的III期微卫星稳定CRC患者中，cIAP1和/或cIAP2 mRNA升高与更短的总生存期相关。其他研究显示cIAP2促进体外5FU耐药，XIAP过表达与CRC无病生存和总生存缩短相关，XIAP还参与放疗抵抗。此外，直肠肿瘤中内源性IAP拮抗剂SMAC高表达与新辅助放疗后更好的降期相关。
基于此，研究人员提出假设：将IAP拮抗剂（SMAC模拟物）加入新辅助方案可恢复凋亡平衡、增强肿瘤应答并改善远期结局。为此采用tol inapant——一种临床阶段IAP拮抗剂，与birinapant、LCL161和xevinapant等早期药物不同，它以相当效力同时抑制cIAP1和XIAP。
二、研究内容与主要结论
该研究旨在利用直肠癌临床前模型评估tol inapant克服IAP介导耐药、改善放疗和化疗疗效的潜力。核心发现包括：放疗在人类直肠肿瘤中诱导TNFα/TNFR1信号和凋亡相关基因集的显著上调，但伴随抗凋亡因子cIAP2和FLIP升高及SMAC（DIABLO）下调，提示放疗虽为肿瘤凋亡做好准备，但抗凋亡信号同时被激活而抑制该应答。Tol inapant通过降解cIAP1/2显著增强放疗诱导的凋亡，TNFα共处理通过caspase-8依赖性机制进一步放大凋亡。体内实验中tol inapant联合放疗耐受良好，肿瘤体积较单纯放疗组有减小趋势但未达统计学显著性。Tol inapant同样增强化疗诱导的凋亡，并在TNFα存在下完全消除5FU诱导的DTP细胞，阻止其恢复增殖。
该研究的意义在于：首次提供tol inapant增强直肠癌放疗和化疗抗肿瘤活性的直接临床前证据；揭示放疗诱导的TNFα信号可作为直肠癌的治疗脆弱性；证明靶向IAP介导耐药并预防5FU耐受持久细胞出现可能改善肿瘤退缩、降低复发并提高非手术管理可能性，为TNT方案纳入IAP拮抗剂提供了机制依据。
三、主要关键技术方法
研究人员采用多种关键技术方法。临床样本方面，纳入42例接受标准新辅助放疗或放化疗的LARC患者（来自英国Beatson West of Scotland癌症中心及Lanarkshire医院），在放疗前（W0）和放疗两周后（W2）通过可弯曲乙状结肠镜采集系列活检标本。转录组分析采用bulk RNA测序（pilot队列用Lexogen QuantSeq 3′试剂盒在Illumina NextSeq平台完成；后续队列用NEBNext试剂盒在NovaSeq平台完成），经STAR/Kallisto比对定量后，使用Limma Voom流程和dream混合效应模型进行差异表达基因分析，以GSVA和MsigDB Hallmark基因集进行基因集富集分析（GSEA）。体外实验采用HCT116（p53-WT，KRAS-Mut）、SW837（p53-Mut，KRAS-Mut）、SW1463（p53-Mut，KRAS-Mut）和COLO320（KRAS-WT）细胞系，以及HCT116 GFP标记和caspase-8敲除衍生物；放疗采用Multi-Rad 160系统（160 kV X射线，2.4 Gy/min），模拟SCRT（5 Gy×5天）和LCCRT（2 Gy×5天+5 μM 5FU）。凋亡检测采用Annexin V/PI流式细胞术，细胞活力采用CellTiter-Glo（2D和3D）检测，活细胞成像采用Incucyte SX5系统，蛋白表达采用Western blotting。体内实验采用SW837细胞皮下异种移植至裸鼠，tol inapant（16 mg/kg）口服灌胃第1–7天，第3天以SARRP平台给予单次10 Gy照射，免疫组化检测Ki67和cleaved caspase-3。
四、研究结果
放疗在人类直肠肿瘤中上调TNFα/TNFR1和凋亡信号。 对35例LARC患者W0和W2活检样本进行bulk RNA测序，共鉴定1720个差异表达基因（1073个上调，647个下调）。IAP相互作用组基因的靶向分析显示，TNFα（TNF）及其受体TNFR1（TNFRSF1A）均显著上调；三种主要IAP中仅cIAP2（BIRC3）在放疗后显著升高；内源性IAP拮抗剂DIABLO（SMAC）显著下降；连接TNFR1信号与细胞死亡的RIPK1显著上调，RIPK3和TRADD也上调。caspase-8未受影响，但其抑制剂FLIP（CFLAR）显著上调。GSEA证实“经NFκB的TNFα信号”和“凋亡”两条hallmark基因集高度激活。KRAS突变状态（占队列26%）不影响上述基因表达变化。
Tol inapant增强放疗诱导的凋亡。 在HCT116、SW837和SW1463三种模型中，tol inapant作为单药对细胞活力影响甚微，但显著增强单次照射（8 Gy）后7天的凋亡水平，部分模型2天即可观察到增强效应。在SW837中，tol inapant显著增强模拟SCRT方案后的凋亡水平，SW1463中效应较弱；在模拟LCCRT方案中，tol inapant对两种直肠癌细胞系均增强凋亡效应，其效果与5FU相当。Tol inapant在单一位数纳摩尔浓度即诱导cIAP1降解，SW1463需要更高浓度；对cIAP2的降解程度因细胞系而异。
TNFα增强tol inapant介导的放射增敏作用。 在SW837中，TNFα增强tol inapant及tol inapant/放疗联合的凋亡应答，而SW1463中无此效应；长期生长实验证实该组合仅在TNFα存在下对SW837有效。HCT116行为类似SW1463。TNFα增强SW837中tol inapant诱导的caspase-3/7和caspase-8活性，但SW1463中无此效应。HCT116球体模型中，tol inapant和TNFα抑制球体生长并降低活力，单次照射后效应进一步增强。caspase-8敲除HCT116证实TNFα对tol inapant/放疗组合的效应依赖caspase-8。
体内疗效评估。 SW837异种移植模型中，tol inapant口服给药第1–7天、第3天照射10 Gy。tol inapant联合放疗耐受良好，肿瘤体积较单纯放疗组有减小趋势但未达统计学显著性；tol inapant单药与vehicle相比具有统计学显著的单药效应。Western blot证实tol inapant有效降解cIAP1，并阻止放疗诱导的cIAP1升高。免疫组化显示联合组肿瘤分数较低、cleaved caspase-3较高，但均未达统计学显著性。
Tol inapant增强化疗诱导的凋亡。 所有模型对FOLFOX诱导凋亡均表现抵抗。Tol inapant单药增强HCT116和SW1463中FOLFOX诱导的凋亡，SW837需TNFα共处理；长期生长和存活实验及HCT116球体模型均证实上述结果。
Tol inapant阻止5FU药物耐受。 5FU连续处理14天诱导SW837和HCT116产生DTP表型（细胞增大、空泡增多）。SW837 5FU-DTP中cIAP1和XIAP轻度下调、cIAP2轻度上调，FLIP两种剪接形式均显著下调；HCT116 5FU-DTP中cIAP1和XIAP更明显下调、cIAP2明显上调，仅长FLIP剪接形式下调。Tol inapant单药即显著抑制SW837 5FU-DTP的出现，TNFα单药也有效；两者联合完全消除5FU-DTP，阻止5FU单药组观察到的再生长。HCT116中tol inapant和TNFα单药均抑制5FU撤除后的恢复，联合用药完全阻断DTP再生长。
五、讨论与结论
讨论部分指出，放疗触发TNFα/TNFR1驱动的炎症程序为肿瘤细胞凋亡做好准备，但cIAP2和FLIP上调及SMAC表达降低同时削弱该信号，这可能是肿瘤细胞在放疗应激下存活的抵抗机制。既往临床观察支持SMAC在调节治疗应答中的作用：SMAC高表达的直肠肿瘤在新辅助治疗后更可能显著降期，低SMAC则与转移性疾病和较差总生存相关。Tol inapant在体外促凋亡效应被外源TNFα强烈增强，体内tol inapant单药活性（体外无此效应）提示肿瘤微环境中存在TNFα，即使免疫缺陷小鼠仍保留可产生TNFα的巨噬细胞和自然杀伤细胞。放疗诱导的TNFα可被IAP抑制利用以激活外源性凋亡的概念得到其他肿瘤类型研究的支持：tol inapant在口腔癌同系模型中显著增强放疗疗效，该效应在TNFα阻断或CD8+T细胞和NK细胞耗竭后消失；HPV阳性和阴性头颈鳞癌异种移植中tol inapant联合分次放疗产生显著肿瘤生长延迟和生存获益。临床上已转化为NCT05245682（头颈鳞癌）和CRAIN试验（宫颈癌）等早期试验。PRAAR1临床试验（NCT05912075）将tol inapant与基于PRODIGE-23方案的TNT联合，但加入含5FU、奥沙利铂和伊立替康的三药化疗骨架可能显著增加毒性，尤其对占直肠癌多数的老年患者。肿瘤内TNFα水平在结直肠肿瘤间差异较大，CMS1和CMS4亚型TNFα表达升高可能对IAP拮抗剂更敏感。基于生物标志物（低SMAC、高IAP表达、高TNFα信号）的患者选择可能提高应答率并减少不必要毒性。乳腺癌临床数据显示简单肿瘤TNFα基因特征可预测LCL161新辅助治疗后的临床完全缓解。DTP细胞代表一种短暂的应激诱导存活状态，使肿瘤细胞耐受细胞毒性治疗并随后以增殖性、常具治疗抵抗的克隆重新出现。结直肠癌中，Cho等通过多重成像鉴定出以高XIAP和低procaspase-3表达为特征的DTP样细胞群，与辅助化疗后复发风险增加相关；Paek等证明IAP上调促成顺铂暴露后DTP形成，该效应可被SMAC模拟物LCL161逆转。本研究显示tol inapant在TNFα存在下可根除5FU诱导的直肠癌DTP细胞，支持靶向凋亡抵抗持久细胞群可能抑制微转移灶并改善远期治疗结局。
研究结论为：本研究首次提供tol inapant增强直肠癌模型中放疗和化疗抗肿瘤活性的直接临床前证据。通过靶向IAP介导耐药并预防5FU耐受持久细胞出现，tol inapant可能提供改善肿瘤退缩、降低复发并提高局部晚期直肠癌非手术管理可能性的新策略。进一步临床研究（理想情况下纳入生物标志物驱动的患者选择）值得开展。
