基于活细胞FRET成像的EGFR L858R突变非小细胞肺癌EGFR-TKI疗效预测

《Clinical and Translational Medicine》：Live-cell FRET imaging-based efficacy prediction of EGFR-TKIs in EGFR L858R-mutant NSCLC

目的： 功能性检测可通过评估肿瘤细胞对抗癌药物的离体（ex vivo）反应，辅助个体化治疗方案的选择。然而，用于评估靶向药物反应的两种主要策略——基于靶点的分析（target-based profiling）和表型分析（phenotypic profiling）——均存在固有局限性。基于靶点的分析无法直接捕获下游细胞命运结局，而表型分析提供的药物作用机制信息有限。 方法： 研究人员采用活细胞荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）显微技术，将EGFRL858R与GRB2之间的相互作用与细胞表型特征相整合，从而在单细胞水平预测EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的疗效。 结果： 基于靶点的药物评分（T-score）源自共表达CFP-EGFRL858R和YFP-GRB2的活细胞中EGFRL858R与GRB2的相互作用，能够评估EGFR-TKIs对EGFRL858R的靶向活性。基于表型的药物评分（P-score）由细胞表型特征构建，表征了EGFR-TKIs诱导的表型反应。整合T-score和P-score的TP-score能够准确预测EGFR-TKIs的疗效。在活H3255细胞中，奥希替尼（osimertinib, OSI）的TP-score高于吉非替尼（gefitinib, GEF）。值得注意的是，在H3255细胞源性异种移植（cell-derived xenograft, CDX）小鼠模型中，OSI相较于GEF显示出更优的体内抗肿瘤疗效。此外，活细胞TP评分显示，一名非小细胞肺癌（NSCLC）患者的原代肿瘤细胞对OSI无反应，这一发现与该患者缺乏可操作的EGFR突变相一致。 结论： 本研究证明了通过整合单活细胞中EGFRL858R-GRB2相互作用与细胞表型特征来预测EGFR-TKI疗效的临床可行性。

论文解读

一、研究背景与问题

临床精准肿瘤学面临的核心挑战是为个体患者匹配最有效的治疗药物。当前精准肿瘤学主要依赖基因组测序来识别患者特异性遗传变异并指导靶向治疗选择，然而基因组引导治疗的临床获益仍然有限，药物匹配成功率约为10%，匹配患者的客观缓解率（objective response rate, ORR）一般不超过20%。具有相同突变的患者对靶向治疗往往表现出不同的敏感性。对于EGFR L858R突变非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），已有超过十种第一至第三代EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）获批，但一项网络荟萃分析发现，在晚期EGFR L858R突变NSCLC中，没有一种一线EGFR-TKI在总生存期（overall survival, OS）方面优于其他一线EGFR-TKI。然而，有研究报道EGFR L858R突变NSCLC患者对不同EGFR-TKIs的敏感性存在显著的个体间差异，提示群体水平证据可能不足以确定个体患者的最佳治疗方案。

作为指导癌症治疗的补充策略，离体（ex vivo）功能性检测针对靶向药物主要采用两种药物筛选策略：评估药物诱导的靶点活性变化和肿瘤样本的表型反应。靶点分析技术如单分子pull-down和免疫共沉淀（single-molecule pull-down and co-immunoprecipitation, SMPC）、基于肽阵列的激酶活性分析以及液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）检测，往往依赖于对死亡癌细胞的分析，且常常无法可靠预测下游生物学效应。例如，有研究报道FLT3表达和磷酸化与38例急性髓系白血病（acute myeloid leukaemia, AML）患者样本对FLT3抑制剂quizartinib的离体细胞活力反应无显著相关性。相反，表型分析可以捕获药物诱导的细胞结局，但无法确定观察到的反应是否由预期药物靶点介导，尤其是在存在脱靶效应的情况下。有研究发现，一名肝癌患者的肿瘤细胞对多靶点TKI索拉非尼表现出超过50%的活力抑制，但随后的全外显子组测序未发现索拉非尼靶向基因的突变。

活细胞荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）成像能够实时监测活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions, PPIs），可用于评估药物诱导的靶点活性变化。高内涵筛选（high-content screening, HCS）无需先验假设即可捕获多参数形态学特征并识别复杂的表型改变，从而表征细胞对药物治疗的反应。在临床应用中，有研究者开发了基于FRET的生物传感器，通过测量慢性髓系白血病（chronic myeloid leukaemia, CML）患者离体骨髓单个核细胞中的BCR-ABL激酶活性来预测BCR-ABL TKIs的临床疗效。在HCS方面，有研究对12例胶质母细胞瘤患者的肿瘤细胞进行HCS分析，识别出一名对MET-TKIs敏感的患者的肿瘤细胞；在一项单臂、开放标签研究中，研究者使用单细胞HCS指导晚期侵袭性血液系统癌症患者的治疗决策，在HCS指导治疗的患者中，54%的患者相较于既往治疗获得超过1.3倍的无进展生存期（progression-free survival, PFS）改善，40%的患者获得至少三倍的绝对PFS延长。

二、研究目的与意义

本研究旨在将活细胞FRET显微镜技术整合EGFR^L858R-GRB2相互作用分析与细胞表型分析，以预测EGFR-TKIs在H3255细胞（一种EGFR L858R突变NSCLC细胞系）中的疗效，并预测一名NSCLC患者原代肿瘤细胞对奥希替尼（osimertinib, OSI）的临床疗效。该研究的意义在于提供一种能够同时评估靶点活性和表型反应的整合性功能性检测方法，弥补基于靶点分析和表型分析各自的局限性，为EGFR L858R突变NSCLC患者的个体化EGFR-TKI选择提供支持。

三、主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：活细胞FRET显微成像技术，用于定量检测共表达CFP-EGFR^L858R和YFP-GRB2的活细胞中EGFR^L858R-GRB2相互作用；基于Cellpose模型的单细胞分割和CellProfiler特征提取，从明场（bright-field, BF）图像和线粒体（MITO）荧光图像中提取单细胞表型特征；线性判别分析（linear discriminant analysis, LDA）用于计算表型药物评分；CCK-8细胞活力检测、集落形成实验和伤口愈合实验用于评估药物体外抗肿瘤活性；CRISPR/Cas9基因敲除技术用于验证EGFR在H3255细胞增殖和OSI抑制作用中的关键作用；H3255细胞源性异种移植（cell-derived xenograft, CDX）小鼠模型用于体内验证；临床样本来源于暨南大学附属第一医院手术切除的肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）患者肿瘤组织，经肿瘤解离试剂盒处理和EpCAM阳性免疫磁珠分选获得原代肿瘤细胞；采用mRNA-based FRET生物传感器转染原代肿瘤细胞；外显子组测序用于验证患者EGFR突变状态。

四、研究结果

3.1 EGFR-GRB2相互作用的生物信息学分析： 研究人员通过STRING数据库构建物理相互作用网络，发现GRB2与所有检测的信号蛋白（除STAT3和STAT5外）均表现出强物理关联，而STAT3在EGFR相互作用蛋白中关联最少。KEGG通路富集分析显示，EGFR与GRB2、STAT3或PLCG1的基因集在NSCLC和EGFR-TKI耐药相关通路中显著富集。在LUAD患者中，EGFR表达与GRB2和PLCG1表达呈正相关。但高PLCG1表达与延长OS和PFS相关，且PLCG1在LUAD组织中的表达显著低于正常对照，提示PLCG1可能参与抑制EGFR激活的负反馈通路，其双重且可能相反的作用表明EGFR-PLCG1相互作用无法可靠预测一致的生物学结局。药物敏感性分析显示，GRB2表达与泛癌数据集中对GEF和阿法替尼（afatinib, AFA）的耐药性呈正相关。因此，GRB2被选为评估EGFR-TKIs靶向活性的FRET生物传感器开发候选蛋白。

3.2 活H3255细胞中基于EGFR^L858R-GRB2相互作用的T-score： 研究人员构建了CFP-EGFR^L858R和YFP-GRB2质粒，EGFR敲除显著降低了细胞增殖，支持EGFR^L858R在H3255细胞增殖中的重要作用。共表达两种蛋白的细胞中，两种蛋白主要在质膜共定位。定量FRET成像分析生成的E_D–R_C结合曲线呈饱和等温线，确认了CFP-EGFR^L858R与YFP-GRB2之间的直接相互作用。OSI处理16小时后，CFP-EGFR^L858R仍留在质膜，而YFP-GRB2弥散分布于细胞质，共定位丧失。定量FRET分析显示OSI处理组曲线较DMSO对照组显著下移，确认OSI有效抑制EGFR^L858R-GRB2相互作用。在R_C范围为2–3时，DMSO处理组平均E_D为0.303，OSI处理组为0.155，OSI的T-score为0.148，定量反映了OSI对EGFR^L858R的靶向抑制活性。

3.3 活H3255细胞中OSI的P-score： 研究人员对DMSO或OSI处理16小时的H3255细胞采集BF和MITO图像，使用Cellpose生成单细胞掩膜并提取BF和MITO特征。UMAP降维显示DMSO和OSI处理细胞群明显分离。基于整合BF和MITO特征的LDA分类器在测试集中达到0.874的曲线下面积（area under the receiver operating characteristic curve, AUC），表明对DMSO和OSI处理细胞具有稳健的区分能力。整合BF和MITO特征集比单独使用任一特征集获得更优的分离效果。DMSO处理组平均预测概率为0.332，OSI处理组为0.489，OSI的P-score为0.157，表明P-score能够定量表征OSI诱导的细胞表型反应。

3.4 活H3255细胞中EGFR-TKIs的TP-score： 根据公式，OSI的TP-score为0.219，显著高于对照组（0）。研究人员进一步将TP评分应用于预测三种EGFR-TKIs（GEF、AFA、OSI）、一种ALK-TKI（阿来替尼，alectinib, ALE）和一种化疗药物（吉西他滨，gemcitabine, GEM）在H3255细胞中的疗效，药物浓度设定为临床推荐剂量下患者中报告的最大血浆浓度（C_max）。所有药物在C_max浓度下均表现出有意义的体外抗肿瘤活性。FRET结果显示GEF、AFA和OSI消除了CFP-EGFR^L858R和YFP-GRB2的共定位，而ALE和GEM未产生显著影响。T-score排名为OSI（1.0）> AFA（0.84）> GEF（0.57）> ALE（0.05）> GEM（0.02）；P-score排名为GEF（1.0）> OSI（0.94）> AFA（0.76）> GEM（0.56）> ALE（0.49）；TP-score排名为OSI（1.0）> AFA（0.68）> GEF（0.65）> ALE（0.02）> GEM（0.01）。TP评分系统预测OSI在H3255细胞模型中相较于GEF具有更强的体内抗肿瘤疗效。

3.5 H3255 CDX模型中的TP-score验证： 研究人员开展了为期21天的H3255 CDX小鼠模型单药治疗研究，GEF（51.4 mg/kg，口服灌胃，每日一次）和OSI（16.4 mg/kg，口服灌胃，每日一次）的剂量基于推荐临床剂量换算为小鼠等效方案。结果显示GEF和OSI均显著抑制肿瘤生长，且OSI的抗肿瘤活性优于GEF。两种药物在整个治疗期间均未引起显著的体重变化。这些发现证实了TP-score预测的OSI在体内具有优于GEF的抗肿瘤疗效。

3.6 活细胞TP评分预测一名NSCLC患者的OSI疗效： 考虑到原代细胞中质粒转染效率有限且细胞毒性高，研究人员将CFP-EGFR^L858R和YFP-GRB2优化为mRNA-based构建体。患者#1（P#1）为43岁男性，左肺可疑恶性肿瘤，接受手术切除，术中冰冻病理确诊为浸润性LUAD，术后病理确认为左上叶IIIA期LUAD（pT1bN2bM0），免疫组化结果为EGFR(+)。由于经济原因，患者未进行基因测序确认EGFR突变状态。由于原代肺癌细胞MITO荧光通道存在显著自发荧光干扰，临床分析中排除了MITO特征。OSI处理消除了CFP-EGFR^L858R与YFP-GRB2的共定位，FRET曲线较对照下移。TP-score分析显示OSI处理细胞的T-score显著增加，但P-score和TP-score均无显著差异，表明OSI虽然有效抑制了P#1肿瘤细胞中的EGFR^L858R-GRB2相互作用，但未能诱导有意义的表型反应，提示有限的治疗获益。随后对剩余患者样本进行EGFR外显子18–21测序，与NCBI参考序列（NM_005228.5）比对确认P#1不存在可操作的EGFR突变，解释了P#1来源肿瘤细胞对OSI不敏感的原因。

五、讨论总结与研究结论

TP评分对GEF和OSI的预测与其在H3255 CDX模型和既往未经治疗的EGFR L858R突变晚期NSCLC患者中观察到的疗效一致，凸显了TP评分在指导精准治疗方面的潜在价值。单细胞TP评分能够区分耐药和敏感亚群，有助于在异质性肿瘤中选择靶向联合治疗策略。TP评分流程保留了细胞活力，检测时长约16小时，从肿瘤切除到最终分析可在48小时内完成，符合临床指南推荐的10天周转时间。采用临床相关的最大血浆药物浓度（C_max）确保了观察到的反应的转化有效性。进一步改进P-score灵敏度可通过引入无监督深度学习方法的单细胞表型分析实现，如MorphoGenie和PhenoProfiler在大型数据集评估中表现优于传统机器学习方法。三维（3D）模型被认为是未来TP评分临床转化的理想平台。

研究结论：本研究证明了通过活细胞FRET显微镜整合EGFR^L858R-GRB2相互作用和细胞表型评估作为预测EGFR-TKI疗效方法的可行性。TP评分有望为癌症患者的个体化治疗决策做出贡献，从而最大限度地减少对无效治疗的暴露。