《Clinical and Translational Medicine》：The long isoform of FABP6 facilitates WWP2-mediated PTEN ubiquitination to activate AKT/mTOR signalling and contributes to reduced everolimus sensitivity in clear cell renal cell carcinoma
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在透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中，PTEN功能在无可检测的基因组改变的情况下如何受损仍未明确。研究人员探讨了脂肪酸结合蛋白6长亚型（long isoform of fatty acid-bi
在透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中，PTEN功能在无可检测的基因组改变的情况下如何受损仍未明确。研究人员探讨了脂肪酸结合蛋白6长亚型（long isoform of fatty acid-binding protein 6，FABP6L）是否参与该过程。通过区分FABP6亚型的分析，研究人员发现FABP6L是主要的肿瘤上调变异体，而短亚型FABP6S未表现出类似的升高。SHOX2的敲低优先降低FABP6L的表达。生化实验将FABP6L与PTEN和E3连接酶WWP2之间增强的相互作用、增强的PTEN多聚泛素化以及降低的PTEN蛋白稳定性联系起来。这些变化伴随AKT/mTOR信号增强。功能获得和功能丧失实验支持FABP6L在培养的ccRCC细胞和异种移植瘤中的促生长作用，而遗传拯救实验表明PTEN对信号传导和生长表型有重要贡献。在对依维莫司敏感性降低的临床前模型中，FABP6L敲低增加了PTEN丰度并增强了对mTOR抑制的反应。这些发现支持一种连接FABP6L与PTEN周转及ccRCC生长的亚型特异性机制，也为研究FABP6L靶向策略以提高依维莫司应答提供了基础，尽管其临床相关性仍需进一步验证。
## 论文解读
### 一、研究背景与科学问题
透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是肾癌最常见的组织学类型，常伴随PI3K–AKT–mTOR信号通路的高度激活，该通路与肿瘤生长、代谢重编程及治疗抵抗密切相关。PTEN是这一通路的主要负调控因子，然而在ccRCC中，PTEN基因的遗传学改变仅能解释部分PTEN活性下降的现象，提示转录后调控机制可能发挥重要作用。已有研究证实泛素-蛋白酶体依赖性蛋白周转可显著影响PTEN丰度，但决定ccRCC中PTEN泛素化的分子因素仍未阐明。
脂肪酸结合蛋白6（fatty acid-binding protein 6，FABP6）基因通过选择性剪接产生两种蛋白亚型：短亚型FABP6S以及含有额外N端片段的FABP6L。既往研究虽报道多种恶性肿瘤中FABP6总表达升高，但多数分析未区分亚型，因此FABP6各亚型在肿瘤中的具体表达变化与功能关联尚不清楚。本研究旨在通过亚型分辨分析，明确FABP6L在ccRCC中的表达特征及其调控PTEN稳定性与AKT/mTOR信号的分子机制，并评估其与依维莫司敏感性的关联。
### 二、研究技术与方法
本研究综合运用了多种实验技术。在临床样本方面，研究人员收集了来自北京大学第三医院81例ccRCC患者的配对肿瘤及癌旁组织。细胞实验涉及多种ccRCC细胞系及永生化正常肾小管细胞HK-2。关键技术方法包括：亚型特异性RT-qPCR和自制FABP6L特异性抗体用于区分亚型表达；慢病毒介导的shRNA敲低与CRISPR-Cas9基因敲除用于功能缺失研究；蛋白质免疫共沉淀结合质谱（co-immunoprecipitation/mass spectrometry，Co-IP/MS）用于鉴定蛋白相互作用；细胞泛素化实验和放线菌酮（cycloheximide，CHX）追踪实验用于评估蛋白稳定性；裸鼠异种移植瘤模型用于体内功能验证；RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）结合KEGG通路富集分析用于转录组层面通路鉴定；染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）和双荧光素酶报告基因实验用于上游转录因子调控分析。
### 三、主要研究结果
**结果1：亚型分辨分析确定FABP6L是ccRCC中过表达的主要FABP6变异体。**研究人员通过对五个独立GEO数据集（GSE53757、GSE40435、GSE16441、GSE16449和GSE36895）的差异表达分析，筛选出190个一致上调基因，其中FABP6与不良总生存期显著相关。利用亚型特异性RT-qPCR和自制FABP6L抗体检测81对临床配对标本，发现FABP6L在肿瘤组织中表达显著高于FABP6S，而FABP6S在肿瘤与癌旁组织间无显著差异。蛋白质水平检测证实FABP6L是ccRCC细胞和肿瘤组织中的优势蛋白亚型。
**结果2：FABP6L促进ccRCC细胞增殖和肿瘤生长。**在FABP6L高表达的SN12C和769-P细胞中，shRNA敲低FABP6L显著抑制DNA合成、克隆形成能力和细胞活力；CRISPR-Cas9敲除实验进一步验证了这一表型。在低表达FABP6L的Caki-1和A-498细胞中，FABP6L过表达显著增强细胞增殖，而FABP6S过表达无类似效应。体内异种移植瘤实验中，FABP6L敲低抑制肿瘤生长，FABP6L过表达则促进肿瘤生长，并伴随Ki-67增殖指数和p-AKT（Thr308）染色增强以及PTEN染色降低。
**结果3：FABP6L通过激活PI3K/AKT信号通路促进ccRCC进程。**RNA-seq和KEGG富集分析显示PI3K–AKT信号通路在FABP6L敲低细胞中显著富集。蛋白水平检测表明，FABP6L过表达增加AKT Ser473和Thr308磷酸化，FABP6L敲低则降低AKT磷酸化以及下游mTORC1效应分子p70S6K（Thr389）和4EBP1（Thr70）的磷酸化。药理学拯救实验证实，AKT激活剂SC-79可恢复FABP6L敲低导致的增殖抑制，AKT抑制剂MK-2206则可抵消FABP6L过表达引起的促增殖效应。
**结果4：SHOX2参与FABP6L上调，FABP6L促进泛素-蛋白酶体介导的PTEN降解。**通过转录因子筛选和功能实验，研究人员鉴定SHOX2为FABP6L的上游转录调控因子。ChIP实验证实SHOX2直接结合FABP6L启动子区域，SHOX2敲低选择性降低FABP6L表达而不影响FABP6S。通过Co-IP/MS鉴定到PTEN为FABP6L的互作蛋白，内源和外源免疫共沉淀均证实FABP6L与PTEN存在相互作用，且该作用具有亚型特异性。FABP6L过表达降低PTEN蛋白水平，而敲低增加PTEN蛋白水平，且不影响PTEN mRNA水平。CHX追踪实验显示FABP6L敲低延长PTEN蛋白半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132而非溶酶体抑制剂氯喹可逆转FABP6L介导的PTEN降低，泛素化实验证实FABP6L敲低减少PTEN多聚泛素化。双向遗传拯救实验表明PTEN在FABP6L介导的信号激活和细胞增殖中发挥重要作用，而PTEN缺失的786-O和OS-RC-2细胞中FABP6L调控效应明显减弱。临床样本相关性分析进一步支持SHOX2–FABP6L–PTEN的关联。
**结果5：FABP6L促进PTEN–WWP2相互作用并增强WWP2相关的PTEN泛素化。**研究人员将Co-IP/MS鉴定的FABP6L互作蛋白与已报道的PTEN靶向E3泛素连接酶取交集，发现WWP2为重要候选。内源Co-IP和免疫荧光实验证实FABP6L、PTEN和WWP2可形成共定位复合物。FABP6L剂量依赖性增强PTEN与WWP2的共沉淀。结构域定位实验显示，FABP6L N端1–60氨基酸区域主要参与WWP2结合，61–120氨基酸区域主要参与PTEN结合，任一区域缺失均显著削弱FABP6L对PTEN–WWP2相互作用的增强效应。WWP2敲低可恢复PTEN丰度并减弱AKT磷酸化，同时降低FABP6L相关的PTEN多聚泛素化。等量FABP6L与FABP6S对比实验进一步支持FABP6L在促进PTEN泛素化中的亚型特异性作用。
**结果6：FABP6L通过PTEN相关的AKT/mTORC1信号降低ccRCC临床前模型对依维莫司的敏感性。**研究人员通过长期逐渐增加依维莫司浓度建立了耐药Caki-1细胞模型（everolimus-R），耐药细胞中FABP6L mRNA表达升高。在依维莫司敏感细胞中，FABP6L敲除降低IC50至2.734μM（对照为6.144μM），回补FABP6L可恢复至5.352μM。在耐药细胞中，FABP6L敲低将IC50从15.18μM降至5.213–6.096μM。体内实验中，FABP6L过表达降低依维莫司的抗肿瘤效果，而FABP6L敲除增强耐药异种移植瘤对依维莫司的应答。信号通路分析显示FABP6L敲低增强依维莫司对p70S6K和4EBP1磷酸化的抑制，PTEN敲低可部分恢复FABP6L敲低引起的信号抑制。
### 四、讨论与结论
本研究的核心发现是：FABP6L而非FABP6S是ccRCC中主要上调的FABP6亚型，其通过促进PTEN与E3连接酶WWP2的相互作用，增强PTEN多聚泛素化及蛋白酶体降解，从而激活AKT/mTOR信号通路并促进肿瘤生长。该机制为ccRCC中非遗传性PTEN失活提供了新的解释。既往针对FABP6的研究多未区分亚型，本研究的亚型分辨分析揭示了FABP6L独特的促癌功能，且不伴随中性脂质蓄积的显著变化。研究人员指出，FABP6L的N端1–60氨基酸区域和61–120氨基酸区域分别参与WWP2和PTEN结合，但细胞实验和AlphaFold3建模尚不能确立原子分辨率的直接蛋白接触界面，未来需借助纯化蛋白重构实验和结构生物学研究验证。
在依维莫司耐药方面，FABP6L–WWP2–PTEN轴通过维持PTEN缺失和AKT/mTOR信号持续激活，可能构成耐药的重要机制。但研究人员亦承认若干局限：耐药实验主要基于单一实验产生的耐药模型，缺乏依维莫司治疗患者的临床注释队列直接验证FABP6L表达与治疗应答的关联，因此FABP6L尚不能被视为耐药预测的临床生物标志物。总体而言，本研究支持FABP6L作为连接非遗传性PTEN失活与ccRCC进展的候选衔接蛋白，也为探索FABP6L靶向策略以提高依维莫司疗效提供了理论基础。
