西伯利亚杏（*Prunus sibirica*）bZIP基因家族全基因组鉴定与特征分析及其在冷胁迫响应中的作用

《Plant Physiology and Biochemistry》：Genome-wide identification and characterization of the bZIP gene family in Siberian apricot ( Prunus sibirica) and their role under cold stress

　　

研究对西伯利亚杏（*Prunus sibirica*）bZIP基因家族进行了全基因组鉴定与特征分析，并探讨了其在冷胁迫响应中的作用。共鉴定出41个PsbZIP基因。PsbZIP28能够形成同源二聚体，并与家族内其他PsbZIP成员相互作用以发挥调控功能。冷胁迫显著诱导PsbZIP28表达强烈上调。过表达PsbZIP28可显著增强植物的耐低温能力。

**一、研究背景与科学问题**

植物在自然环境中持续面临干旱、盐碱等非生物胁迫以及病原侵染等生物胁迫。其中，低温是限制植物生长发育、决定物种生产力与空间分布的最普遍非生物胁迫因素之一，可分为冷害（0–15 °C）和冻害（<0 °C）两类。低温胁迫触发植物细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）的过量积累，引发膜脂过氧化、细胞结构损伤及蛋白质、核酸等大分子功能受损，进而抑制生长、改变生理结构，严重时可致植株死亡。此外，低温还影响细胞壁流动性与完整性，细胞间隙冰晶形成会限制水分运动并破坏细胞壁，最终导致细胞死亡。对果树而言，低温胁迫不仅造成外部形态长势迟缓、花芽与果实发育受损，还引起细胞膜从液晶态向凝胶态转变、膜透性增加、胞质环流受阻、酶活性改变、光合速率下降等内部结构变化。

在植物适应非生物胁迫的调控网络中，碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子（transcription factor, TF）家族是植物中最大的TF家族之一，其家族成员含有由碱性结构域和亮氨酸拉链结构域组成的、长度为60–80个氨基酸的保守bZIP结构域。bZIP蛋白优先结合ACGT核心序列，广泛参与种子成熟与萌发、花发育、维管组织形成、胚胎发育等生物学过程，并在冷害与冻害胁迫的适应性响应中发挥关键调控作用。例如，小麦TaABI5通过冷响应TF TaICE1物理互作增强耐寒性；番茄SlHY5激活SlBBX31启动子促进冷诱导的SlCBFs表达；杜梨PbbZIP11经CBF依赖途径增强拟南芥冷胁迫耐受性。

西伯利亚杏（*Prunus sibirica*）是蔷薇科木本植物，对我国温带和暖温带地区具有极强的生态适应性，能在干旱、贫瘠、低温和风大等恶劣条件下正常生长，在防风固沙、水土保持等生态修复中发挥重要作用。杏核富含蛋白质、维生素和苦杏仁苷等营养成分与药用物质，兼具显著的经济与药用价值。然而，近年来频繁发生的春季晚霜严重影响了杏树的生殖生长，花期突然降温不仅损伤花芽、花朵和幼果，还会妨碍授粉，造成重大经济损失。为缓解花期低温胁迫对西伯利亚杏产量和品质的不利影响，鉴定和表征生殖器官冷胁迫响应中的关键基因，是阐明耐寒分子机制、推进抗逆遗传改良的重要策略。然而，截至目前，西伯利亚杏中bZIP基因家族尚未见系统研究报道。为此，研究人员开展了本项全基因组水平鉴定与功能分析工作。

**二、研究内容概述**

研究人员利用西伯利亚杏基因组数据，通过Profile Hidden Markov Model（HMM）搜索结合Pfam与NCBI-CDD数据库验证，共鉴定出41个PsbZIP基因，系统命名为PsbZIP1至PsbZIP41。随后综合运用系统发育分析、多序列比对、基因结构分析、保守基序分析、染色体定位、基因重复事件与共线性分析、顺式作用元件预测、GO注释以及蛋白互作网络预测等生物信息学手段，对PsbZIP基因家族进行了全面特征解析。在此基础上，研究人员整合冷处理实验、转录组数据分析（数据来源于NCBI GEO数据库，登录号GSE204685，包含耐寒株系'NO. 453'和冷敏感株系'NO. 371'在西伯利亚杏雌蕊中的时间序列表达数据）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）验证，系统分析了PsbZIPs在不同组织及低温胁迫时间序列下的表达谱。特别值得注意的是，PsbZIP28在冷胁迫下被显著诱导。基于此发现，研究人员通过大青杨（*Populus ussuriensis*）瞬时遗传转化、亚细胞定位和酵母自激活等实验，初步验证了PsbZIP28在低温胁迫下的调控功能及作用机制。研究结果为预测PsbZIPs功能提供了科学依据，为西伯利亚杏稳产优质栽培奠定了理论基础和技术支撑，并为未来通过分子育种策略进行种质改良奠定了基础。

**三、主要关键技术方法**

研究人员使用了以下主要技术方法：（1）生物信息学鉴定与表征：利用HMMER 3.4搜索bZIP结构域（PF00170），经Pfam和NCBI-CDD验证后，使用ExPASy ProtParam预测理化性质，Plant-mPLoc预测亚细胞定位；（2）系统发育与基因结构分析：使用MEGA 12.1构建邻接法系统发育树（1,000次bootstrap），Jalview进行多序列比对，MEME分析保守基序，TBtools可视化基因结构；（3）进化分析：MCScanX进行共线性分析并计算Ka/Ks比值；（4）顺式作用元件与互作网络预测：PlantCARE预测启动子顺式作用元件，STRING数据库预测蛋白互作网络；（5）转录组数据分析与qRT-PCR验证：使用NCBI GEO（GSE204685）转录组数据进行差异表达分析，qRT-PCR以18S rRNA为内参基因，采用2^-ΔΔCT法计算相对表达量；（6）亚细胞定位：构建35S::PsbZIP28-GFP融合表达载体，农杆菌介导法浸润本氏烟（*Nicotiana benthamiana*）叶片后激光共聚焦显微镜观察；（7）转录自激活检测：将PsbZIP28不同截短片段克隆至pGBKT7载体，转化Y2HGold酵母菌株，在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上检测转录激活活性；（8）瞬时过表达及生理检测：通过农杆菌介导真空浸润法转化大青杨组培苗，低温处理后进行DAB、NBT、伊文思蓝组织化学染色，并测定丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性。植物材料方面，西伯利亚杏品种'Shanxing5'采自辽宁国家李杏种质资源保存与育种长期科研基地（119°32′49″ E, 41°17′27″ N；辽宁喀左），低温处理于人工冷冻室?4 °C条件下进行。

**四、研究结果**

**4.1 西伯利亚杏中PsbZIPs的鉴定与特征分析**

研究人员以bZIP结构域HMM模型（PF00170）在基因组范围内搜索，共鉴定出41个PsbZIP基因。Pfam和NCBI-CDD验证确认所有候选蛋白均含有完整的bZIP结构域。其编码蛋白长度介于136个氨基酸（PsbZIP35）至599个氨基酸（PsbZIP5）之间，平均为319个氨基酸；分子量介于15,818.36 Da至65,910.43 Da，平均35,281.11 Da；理论等电点（pI）介于4.37（PsbZIP38）至10.26（PsbZIP28）之间。亚细胞定位预测显示，全部41个PsbZIP蛋白均定位于细胞核。

**4.2 PsbZIPs系统发育与蛋白特征分析**

利用西伯利亚杏、毛果杨（*Populus trichocarpa*）和拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）的bZIP蛋白序列构建系统发育树，参照拟南芥bZIP亚家族分类标准，将全部序列划分为13个亚组。其中，K亚组仅含AtbZIPs而不含PsbZIPs，其余12个亚组均包含PsbZIPs。S亚组所含PsbZIP成员最多（8个），J和M亚组各仅含1个PsbZIP。多序列比对显示，bZIP结构域的基本区含有高度保守的N-X7-R/K基序，亮氨酸拉链区由多个疏水氨基酸七价重复组成，部分保守亮氨酸残基被异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸等疏水氨基酸替代。保守基序分析共鉴定出17个保守基序，其中Motif 1存在于所有PsbZIPs中，被认定为保守的bZIP结构域；H亚组成员含基序数量最少（PsbZIP2和PsbZIP10各仅含1个基序），D亚组成员含基序最多（PsbZIP11和PsbZIP27各含7个基序）。基因结构分析显示，PsbZIPs外显子数目为1–12个，G和D亚组含较多外显子（4–12个），S亚组全部成员缺乏内含子。蛋白结构域分析发现D亚组成员除bZIP结构域外还含有特化的DOG1结构域。

**4.3 PsbZIPs的染色体定位、基因重复、共线性和Ka/Ks分析**

染色体定位分析显示，41个PsbZIPs不均匀地分布在7条染色体上。1号染色体含最多PsbZIPs（13个），3号染色体含最少（2个）。基因重复分析发现8对PsbZIP基因源于片段重复事件，未发现串联重复基因对。Ka/Ks比值分析显示所有8对重复基因对的Ka/Ks值范围为0.14–0.50，均小于1.0，表明该基因家族在进化过程中经历了强烈的纯化选择。与5个物种的比较共线性分析显示，PsbZIPs与桃（*Prunus persica*）和李（*Prunus salicina*）的直系同源基因对数量相同且最多（均为54对），其次为甜樱桃（*Prunus avium*，50对）、梅（*Prunus mume*，46对）和拟南芥（37对），表明蔷薇科物种间存在高度保守的共线性关系。

**4.4 PsbZIPs的顺式作用元件、GO注释及蛋白互作分析**

对PsbZIPs起始密码子上游2,000 bp启动子区的顺式作用元件预测结果显示，这些基因的启动子区域富含4大功能类别的顺式作用元件：植物生长发育相关、光响应、胁迫响应和激素响应元件。除与个体发育（昼夜节律、O2位点、CAT-box、AACA_motif）和光响应（TCT-motif、Box 4、Sp1、GT1-motif、G-box）相关的元件外，许多PsbZIP基因还含有大量激素响应元件，包括ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif和P-box。值得注意的是，胁迫响应元件在PsbZIP启动子中被频繁鉴定到，其中低温响应元件（LTR）存在于多个基因中，PsbZIP28启动子区含有抗氧化响应元件ARE和防御/胁迫响应元件TC-rich repeats，以及多种光响应、激素响应和生长发育相关调控元件。GO富集分析显示，PsbZIP蛋白主要参与刺激响应、细胞刺激响应、胁迫响应和非生物刺激响应等生物学过程；在细胞组分方面主要定位于细胞核、膜包被细胞器和胞内细胞器；在分子功能方面主要具有转录调控活性、DNA结合TF活性和结合功能。蛋白互作网络预测结果表明，23个PsbZIP蛋白可能与5个以上AtbZIP蛋白发生互作，其中PsbZIP33（与AtbZIP53同源）的互作网络最为广泛，共与18个蛋白存在潜在互作关系。

**4.5 PsbZIPs转录组数据分析**

利用耐寒株系'NO. 453'和冷敏感株系'NO. 371'雌蕊在低温处理0、15、30 min、1 h和2 h的转录组数据，研究人员分析了PsbZIPs的表达模式并绘制了基因表达热图。结果显示，PsbZIP5在处理15 min后表达显著上调，PsbZIP19、PsbZIP12和PsbZIP35在1 h后显著上调，PsbZIP40在低温处理2 h后显著上调，PsbZIP28也表现出类似的显著上调模式，其表达水平明显高于对照组（0 h）。总体而言，共有40个PsbZIPs在不同低温胁迫时长下被显著诱导或抑制。

**4.6 PsbZIPs在不同组织中的表达分析**

研究人员利用qRT-PCR检测了20个PsbZIPs在西伯利亚杏根、花瓣、茎、雌蕊和叶片5种组织中的表达谱。结果显示，3个基因（PsbZIP5、PsbZIP20和PsbZIP40）在雌蕊中特异性高表达，其中PsbZIP5和PsbZIP20的表达量达到对照的12.5倍，PsbZIP40为2.9倍；7个基因（PsbZIP2、PsbZIP7、PsbZIP8、PsbZIP9、PsbZIP12、PsbZIP33和PsbZIP35）在叶片中高表达，其中PsbZIP35上调约49倍；PsbZIP3、PsbZIP13、PsbZIP14、PsbZIP17和PsbZIP19在茎中高表达；PsbZIP12、PsbZIP15、PsbZIP21和PsbZIP28在花瓣中高表达。

**4.7 PsbZIPs在低温胁迫下的表达分析**

研究人员利用qRT-PCR检测了20个PsbZIPs在低温处理不同时间点的转录积累情况。结果表明，随着低温胁迫时间的延长，PsbZIP9、PsbZIP13和PsbZIP28在胁迫早期（15 min）显著上调，而PsbZIP7和PsbZIP8在后期（2 h）达到最高表达水平。PsbZIP28在15 min时达到峰值表达，约为对照的14倍，高于其余4个时间点的表达水平，提示PsbZIP28在此阶段对低温胁迫的响应最为强烈。

**4.8 PsbZIP28的亚细胞定位分析**

研究人员构建35S::PsbZIP28-GFP融合表达载体，通过农杆菌介导法在本氏烟叶片中进行瞬时表达。激光共聚焦显微镜观察显示，与GFP对照相比，PsbZIP28-GFP融合蛋白仅在细胞核中发射绿色荧光，证实PsbZIP28定位于细胞核。

**4.9 PsbZIP28转录自激活分析**

研究人员根据PsbZIP28的单个bZIP结构域（basic region leucin zipper, BRLZ）将其分为N端区域（NTR）、bZIP和C端区域（CTR），设计6个截短片段并分别克隆至pGBKT7-BD载体。酵母自激活检测结果显示，含有CTR的重组酵母菌株能在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上正常生长，而不含CTR的菌株则无法在该培养基上形成菌落。该结果证明PsbZIP28具有转录激活活性，且其激活结构域定位于CTR。

**4.10 PsbZIP28瞬时过表达增强大青杨耐寒性**

鉴于PsbZIP28受冷胁迫诱导，研究人员在大青杨中进行瞬时过表达以研究其在耐寒性中的作用。qRT-PCR确认PsbZIP28过表达株系中该基因转录本丰度较空载体对照高约80倍，表明瞬时过表达系统成功建立。经?4 °C低温处理后，DAB、NBT和伊文思蓝组织化学染色结果显示，过表达PsbZIP28的叶片中染色强度显著低于对照叶片，表明H₂O₂和O₂^?积累减少、细胞膜完整性维持较好。生理指标测定显示，冷胁迫6 h后，过表达株系的丙二醛（MDA）含量较对照显著降低，可溶性蛋白和可溶性糖含量显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均显著高于对照组。上述生理结果与组织化学染色结果一致，表明PsbZIP28过表达通过增强ROS清除能力和减轻氧化损伤来提高植物的耐低温能力。

**五、讨论总结与研究结论**

讨论部分指出，bZIP基因家族成员数量在不同物种间存在显著差异。西伯利亚杏中鉴定的41个PsbZIPs数量较拟南芥（78个）低约47.44%，较毛果杨（86个）低约52.33%，推测西伯利亚杏在拟南芥γ全基因组复制事件后未发生额外全基因组复制（whole-genome duplication, WGD）事件。PsbZIPs数目与同为蔷薇科的梅（49个）相近，提示bZIP家族在该谱系内大小相对保守。系统发育分析显示西伯利亚杏缺少K亚组成员，与梅中的情况类似，提示该亚组成员或在西伯利亚杏基因组进化过程中缺失。S亚组在PsbZIPs中含成员最多，这一分布模式与拟南芥中的亚组分布一致。PsbZIP28是拟南芥S亚组代表性成员AtbZIP1的同源蛋白，AtbZIP1通过与ABA响应元件（ABRE）特异性结合参与ABA信号转导，从而介导植物对冷胁迫的适应性响应。PsbZIP28的启动子区含有ABRE和厌氧响应元件，支持其在冷胁迫条件下整合激素与胁迫相关信号通路的潜在作用。在表达模式方面，不同PsbZIPs在组织中的转录丰度各异，其表达模式与同源拟南芥基因的功能具有一定关联性，如PsbZIP5（AtbZIP30同源物）在雌蕊中高表达，提示其可能参与西伯利亚杏雌蕊发育；PsbZIP27（TGA4同源物）在根中高表达，提示其可能参与根发育。PsbZIP28在根中高表达，结合其同源基因AtbZIP1在根中受盐、冷、旱等非生物胁迫显著诱导的特性，提示PsbZIP28可能通过ABA介导的长距离信号途径影响地上组织的非生物胁迫响应和冷驯化。在功能验证层面，PsbZIP28的核定位和CTR转录激活活性共同表明其作为转录激活因子发挥作用。其快速诱导表达模式符合上游调控因子或信号放大途径关键组分的特征。过表达PsbZIP28显著增强大青杨耐寒性的生理机制包括：降低MDA积累（减轻膜脂过氧化损伤）、增加可溶性糖和可溶性蛋白等渗透保护物质含量、提高SOD、POD和CAT活性以增强ROS清除能力。上述研究结果共同支持PsbZIP28作为西伯利亚杏冷胁迫响应的关键正调控因子。

研究结论可总结为：本研究在西伯利亚杏中鉴定出41个PsbZIPs，依据基因结构和保守基序特征将PsbZIP基因家族划分为12个亚家族；启动子分析发现其含有多种与冷胁迫响应相关的顺式作用元件；PsbZIPs的表达模式在不同组织及低温处理不同时长下呈现差异；功能分析证明PsbZIP28具有转录激活活性，且其过表达能显著增强转基因植物的耐低温能力；PsbZIP28定位于细胞核，支持其作为转录调控因子的作用。上述发现揭示了PsbZIP基因家族在西伯利亚杏冷胁迫响应中的重要调控功能，并确立了PsbZIP28作为耐寒性关键调控因子的地位，为木本植物冷胁迫响应的分子机制提供了新见解，为西伯利亚杏耐寒性遗传改良和耐寒种质创制奠定了重要的理论与遗传基础。