《Diabetic Medicine》：Characterising differential maturation of stem cell-derived islets in mice: Graft function and transcriptomic analysis
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目的：干细胞来源胰岛（SC-islets）有望彻底改变1型糖尿病（T1D）的治疗。然而，体内（in vivo）功能性成熟存在变异性，提示特定但尚未定义的环境线索至关重要。研究人员旨在鉴定与SC-islets在小鼠体内成熟相关的通路，评估其早期功能标志物，并确定
目的：干细胞来源胰岛（SC-islets）有望彻底改变1型糖尿病（T1D）的治疗。然而，体内（in vivo）功能性成熟存在变异性，提示特定但尚未定义的环境线索至关重要。研究人员旨在鉴定与SC-islets在小鼠体内成熟相关的通路，评估其早期功能标志物，并确定高血糖移植物环境是否损害该过程。
方法：研究人员选取移植了800个SC-islets但表现出不同血糖结局（治愈、半治愈、未治愈）的小鼠，并随时间测量葡萄糖耐量和人C肽（C-peptide）浓度。将治愈小鼠移植物的单细胞转录组分析（single-cell transcriptomic analysis）与体外（in vitro）维持的SC-islets进行比较。通过比较移植后1个月分别处于高血糖或正常血糖状态的小鼠SC-islets移植物受者，评估高血糖对体内成熟的影响。
结果：SC-islets体内成熟的优越性总体与C肽和葡萄糖耐量的进行性改善相关。与体外维持的SC-islets相比，体内成熟与独特的转录组模式（包括MAFA和INS表达增加）相关。最后，移植后高血糖环境不影响长期SC-islets成熟，在6个月时血浆人C肽未见受损，且SC-islets移植入糖尿病小鼠后β细胞成熟标志物的基因表达无变化。
结论：纵向血浆C肽和葡萄糖耐量可用于表征SC-islets体内成熟，其与体外未观察到的转录组变化相关。此外，升高的血糖不会损害长期功能性成熟。这些发现支持体内线索对SC-islets成熟的重要性，为未来的临床前研究提供信息。
研究背景：1型糖尿病（T1D）患者依赖外源性胰岛素维持生命，胰岛移植可提供生理性血糖调控，但供体胰岛严重短缺。干细胞来源胰岛（SC-islets）由多能干细胞分化获得，显示出与原代人胰岛相似的部分功能，被认为是解决供体不足的突破性方向。然而，SC-islets在体外培养条件下仅具备基础胰岛素分泌能力，其完全的葡萄糖反应性成熟通常要待移植入小鼠后才会出现，且不同个体移植物的成熟程度差异很大，表现为部分受体能恢复血糖正常，而另一些则不能。这种差异提示，受体体内存在关键但尚未被鉴定的环境线索，它们可能调控SC-islets的功能成熟。为了改进移植策略，需要客观评价体内成熟程度的指标，并鉴定成熟相关的分子通路。此外，移植后血糖水平是否影响SC-islets成熟也需明确，因为高血糖在临床移植中被视为不利于移植物存活的因素。
研究人员开展的研究：本研究选用同一分化批次、同数量（800个）SC-islets移植到免疫缺陷NSG小鼠肾被膜下，通过链脲佐菌素（STZ，一种诱导糖尿病药物）消融小鼠自身β细胞，建立内源胰岛素缺乏模型。根据移植后血糖结果将受体分为治愈（血糖<10 mM）、半治愈（10–20 mM且渐改善）和未治愈（持续>20 mM）。研究人员随后每月监测非空腹和空腹血糖，进行葡萄糖耐量试验（GTT）并检测血浆人C肽，比较不同组的功能动态。在实验终点（7个月）切除移植肾，确认移植物对血糖控制的贡献。接着，对治愈小鼠移植物进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），并与同期体外培养的SC-islets以及原代人胰岛进行比较，分析β细胞成熟转录谱。最后，通过移植前或移植后给予STZ制造高血糖或正常血糖的移植后环境，比较两组在6个月内的功能成熟指标和移植物基因表达。
主要技术方法：SC-islets由H1人胚胎干细胞（hESC）按照七阶段赫尔辛基协议分化，移植前用免疫荧光确认胰岛素/胰高血糖素阳性细胞。移植模型使用8-10周龄NSG小鼠（Charles River, UK），每只肾被膜下移植800个SC-islets，并以STZ（70 mg/kg，连续5天）消融内源β细胞；部分小鼠在移植前诱导糖尿病，另一部分在移植后1.5个月给药。功能评估包括每月6小时禁食血糖、腹腔葡萄糖耐量试验（2 g/kg葡萄糖）及ELISA检测30分钟时血浆人C肽。单细胞RNA测序使用10x Genomics Chromium平台，Cell Ranger v9.0.1比对到GRCh38参考基因组，经Scanpy进行PCA、UMAP降维及Leiden聚类，并用PAGA和扩散伪时间推断β细胞成熟轨迹；qPCR用于检测移植肾组织中INS、MAFA、PDX1、NKX6.1、GCG、SST表达。
研究结果：
3.1 SC-islets体外功能不成熟：第7阶段第3周SC-islets胰岛素含量接近人胰岛，但静态和动态灌流试验均未显示葡萄糖浓度依赖性胰岛素分泌；加入腺苷酸环化酶激活剂forskolin后可迅速且可逆地增加分泌，说明分泌机制部分存在。到第6周，葡萄糖刺激性胰岛素分泌（GSIS）有所改善，但仍显著弱于人胰岛，提示体外培养下成熟受限。
3.2 体内SC-islets功能成熟具有差异性：移植相同材料的受体在STZ后呈现三种血糖表型：治愈鼠非空腹血糖平均5.6 mM，空腹3.3 mM；半治愈鼠早期非空腹16.2 mM，后逐渐降至12.3 mM，空腹血糖一直正常；未治愈鼠持续高血糖（23.9 mM）。肾切除后三只鼠均高血糖，表明血清差异并非源于内源β细胞残留。
3.3 葡萄糖耐量与血浆C肽随时间可反映体内成熟：治愈鼠从移植后2个月起，葡萄糖耐量进行性改善，C肽从973 pM逐步升至4个月时的2069 pM并稳定；半治愈鼠C肽初始428 pM，5-7个月达到1159-1747 pM，葡萄糖耐量在STZ后受损但6个月恢复至术前；未治愈鼠2个月C肽仅174 pM且无改善，因空腹血糖过高无法进行后续GTT。
3.4 体内环境驱动β细胞成熟：单细胞轨迹分析显示，体内维持的SC-β细胞主要分布在中间成熟区，但相比体外维持的SC-β细胞更接近成熟末端，且仍不及原代人β细胞。体内组中MAFA和INS表达高于体外组；VIM是体内组下调最显著的基因，RACK1上调。此外，体内移植物中β细胞比例更高（40.9% vs 16.0%），α细胞比例较低但α细胞转录谱无差异。
3.5 高血糖移植后环境不损害长期成熟：移植前STZ组在高血糖约1.5个月后逐渐恢复正常，6个月时血浆人C肽（1993±452 pM）高于移植后STZ组（922±80 pM），但两组葡萄糖耐量在6个月时相当，qPCR显示INS、MAFA、PDX1、NKX6.1等成熟标志物表达无差异，且均低于人胰岛。
讨论与结论：讨论部分指出，纵向C肽和葡萄糖耐量曲线能够区分不同的体内成熟轨迹，可作为临床前评估SC-islets移植物的功能指标。体内成熟伴随着转录组状态的变化，包括成熟基因上调以及非内分泌/间充质标志物（如VIM）的抑制，这些变化在等时间体外培养中不发生，表明受体环境对成熟的重要驱动作用。高血糖暴露（约1.5个月）并未损害6个月时的功能成熟，提示短时高血糖可能不是阻碍长期成熟的决定性因素。本研究的局限性在于仅治愈鼠移植物获得了足够的内分泌细胞进行单细胞测序，无法比较不同功能结局的转录组差异。结论：纵向血浆C肽和葡萄糖耐量可用于表征SC-islets体内成熟，且这种成熟与体外未见的转录组改变相关；高血糖不损害长期功能成熟；这些结果支持体内线索对SC-islets成熟具有重要意义，为未来临床前研究和临床应用提供依据。
