摘要专业翻译
背景： 四逆汤（Si Ni decoction，SND）以其抗炎、免疫调节和改善微循环的作用而闻名。然而，其在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）中的分子机制仍不清楚。本研究旨在探讨SND通过线粒体自噬调控巨噬细胞极化从而稳定下肢动脉粥样硬化斑块的机制。
材料与方法： 采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7巨噬细胞建立AS模型，并分为五组[空白组（BG）、模型组（MG）、低剂量组（LDG）、中剂量组（MDG）和高剂量组（HDG）]。检测各组促炎与抗炎细胞因子、M1和M2巨噬细胞标志物、线粒体自噬相关蛋白的表达以及细胞活力（cell viability，CV）。
结果： 与MG相比，在LDG、MDG和HDG中，随着药物剂量的增加，促炎细胞因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平逐渐降低，而IL-10的水平升高；CD16/32和COX2明显减少，Arg1和CD206明显升高；LC3、Parkin、FUNDC1明显减少，而P62和CV明显升高（p?
论文解读
一、研究背景与意义
下肢动脉粥样硬化（lower extremity atherosclerosis，LEA）是外周动脉疾病（peripheral artery disease，PAD）的主要亚型，表现为下肢血管进行性动脉狭窄、血管硬化和血栓性闭塞，导致血流不足并出现间歇性跛行、肌无力、疼痛以及严重缺血性溃疡和坏死等临床症状。LEA不仅显著影响患者生活质量，还是全身心血管疾病的危险放大器，已成为影响全球健康的重要疾病之一。随着人口老龄化加剧和高脂血症等患病率上升，LEA的发病率持续升高。LEA的病理特征主要包括动脉内膜脂质沉积、平滑肌细胞增殖、纤维组织形成以及巨噬细胞等免疫细胞浸润，最终导致斑块形成。这些斑块可引起血管腔狭窄，严重时可致血栓形成，导致组织缺血或坏死。斑块破裂和血栓形成是心血管事件的主要决定因素，其中巨噬细胞在该过程中发挥关键作用。巨噬细胞在AS不同阶段发挥不同作用，尤其在斑块形成、稳定和破裂过程中，其极化状态显著影响斑块稳定性。
在治疗方面，尽管药物疗法（如他汀类和抗血小板药物）已广泛用于LEA的临床管理，但现有治疗方案虽能在一定程度上延缓疾病进展，却往往无法完全逆转斑块形成和稳定，且可能伴随一定副作用。因此，寻找新的治疗靶点和策略，尤其是通过调节免疫和炎症反应来稳定斑块，已成为近年研究热点之一。四逆汤（Si Ni decoction，SND）源自《伤寒论》，具有温阳、活血、改善循环的作用，历史上用于治疗阳虚所致的寒证。近年来，随着中医药现代化进程，SND已广泛用作多种心血管疾病的辅助治疗。大量研究表明，SND不仅能调节心血管功能，还能改善血液循环、抑制炎症反应、增强免疫力。研究发现SND可通过多种途径延缓AS进展，包括调节内皮细胞功能、抑制巨噬细胞活化和降低血脂等。然而，SND调控巨噬细胞极化和斑块稳定性的具体机制尚未完全阐明。
越来越多的证据表明，核受体辅阻遏物1（nuclear receptor corepressor 1，NCOR1）作为关键转录辅阻遏物，在巨噬细胞炎症表型转换和线粒体稳态调节中发挥重要作用。Oppi等发现巨噬细胞特异性NCOR1缺陷可显著加重小鼠动脉粥样硬化病变，表现为泡沫细胞形成增加、促炎细胞因子表达上调、坏死核心扩大和纤维帽变薄。机制上，NCOR1主要通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）的促动脉粥样硬化活性发挥保护作用。值得注意的是，人动脉粥样硬化斑块中NCOR1表达水平降低，且破裂斑块中的降低比未破裂斑块更明显。Chen等进一步证明NCOR1参与调控巨噬细胞葡萄糖代谢重编程，该过程与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。尽管上述证据凸显了NCOR1在动脉粥样硬化中的关键作用，但SND对巨噬细胞的抗炎和功能调节作用是否也通过NCOR1介导仍不清楚。为填补这一研究空白，本研究将NCOR1确定为潜在通路靶点，试图探索SND的分子机制，即在体外水平观察SND对NCOR1相关线粒体自噬和巨噬细胞极化的调控，从而阐明SND减轻动脉粥样硬化炎症损伤的可能途径。
二、研究设计与技术方法
研究人员选用RAW 264.7巨噬细胞系作为研究对象，细胞由上海中医药大学附属上海市中西医结合医院提供。采用1?μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7细胞24小时建立AS细胞模型。实验分为空白组（BG）、模型组（MG）以及低剂量组（LDG）、中剂量组（MDG）和高剂量组（HDG）三个SND含药血清干预组，每组设三个独立生物学重复。SND含药血清的制备依据经典方剂称取生药，水煎两次，合并滤液减压浓缩并冻干获得SND冻干粉；健康大鼠连续灌胃给药，空白大鼠平行给予等量生理盐水；末次给药后腹主动脉采血，分离血清，56°C水浴灭活30分钟，经0.22?μM滤膜过滤除菌后分装保存于?80°C。基于预实验细胞毒性结果，将含药血清梯度稀释确定三个干预浓度，空白大鼠血清平行稀释作为对照。LPS刺激24小时后，LDG、MDG和HDG组细胞加入相应浓度SND含药血清继续孵育24小时，BG和MG组给予等量空白大鼠血清。
主要技术方法包括：实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测IL-6、TNF-α、IL-10、CD16/32、COX2、Arg1、CD206和NCOR1的mRNA表达，以GAPDH为内参基因，采用2
?ΔΔCt法计算相对表达量；蛋白质印迹法（Western blotting，WB）检测线粒体自噬相关蛋白（LC3、Parkin、P62、NCOR1和FUNDC1）的表达，以GAPDH为内参，使用ImageJ软件分析条带灰度值；Seahorse XF96实时细胞分析仪检测线粒体功能，测定各组的氧气消耗率（oxygen consumption rate，OCR）和细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），采用标准线粒体压力测试程序依次自动注入寡霉素（ATP合酶抑制剂）、FCCP（线粒体解偶联剂）以及鱼藤酮联合抗霉素A（复合物I/III抑制剂），所有OCR和ECAR值均归一化至相应总蛋白量；MTS法检测细胞活力（cell viability，CV），在490?nm处测定吸光度（OD）值。统计学处理采用SPSS 24.0软件，正态分布计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法校正，非正态分布资料采用Mann-Whitney检验，计数资料采用χ2检验，
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三、研究结果
3.1 各组促炎细胞因子mRNA表达变化： 与BG相比，MG中IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著升高（p?=?0.002和p?=?0.003）。与MG相比，LDG、MDG和HDG中IL-6和TNF-α的表达随药物剂量增加逐渐降低，HDG与BG之间无显著差异（均p?>?0.05）。表明SND呈剂量依赖性地抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎细胞因子表达。
3.2 各组抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达变化： 与BG相比，MG中IL-10的mRNA表达水平显著降低（p?=?0.001）。与MG相比，LDG、MDG和HDG中IL-10表达随药物剂量增加呈剂量依赖性升高，HDG与BG之间无显著差异（p?>?0.05）。表明SND可促进抗炎细胞因子IL-10的表达。
3.3 各组M1巨噬细胞标志物mRNA表达变化： 与BG相比，MG中CD16/32（p?=?0.018）和COX2（p?p?>?0.05）。表明SND可抑制M1型巨噬细胞极化标志物的表达。
3.4 各组M2巨噬细胞标志物mRNA表达变化： 与BG相比，MG中Arg1（p?=?0.001）和CD206（p?=?0.002）的mRNA表达水平显著降低。与MG相比，随着药物浓度增加，LDG、MDG和HDG中Arg1和CD206的表达逐渐升高，HDG与BG之间无显著差异（均p?>?0.05）。表明SND可促进M2型巨噬细胞极化标志物的表达。
3.5 各组线粒体自噬相关蛋白表达变化： 与BG相比，MG中LC3（p?=?0.002）、Parkin（p?p?=?0.003）的蛋白表达水平显著升高，而P62表达（p?=?0.004）显著降低。与MG相比，随着药物浓度增加，LDG、MDG和HDG中LC3、Parkin和FUNDC1的表达逐渐降低，而P62表达逐渐升高，HDG与BG之间无显著差异（均p?>?0.05）。表明SND可改善LPS诱导的异常线粒体自噬。
3.6 各组线粒体功能指标OCR和ECAR变化： 与BG相比，MG中OCR水平显著降低（p?p?p?>?0.05）。表明SND可恢复LPS损伤的巨噬细胞线粒体功能，改善有氧代谢并降低糖酵解活性。
3.7 各组细胞活力变化： 与BG相比，MG中细胞活力显著降低（p?p?>?0.05）。表明SND可剂量依赖性地恢复LPS损伤的巨噬细胞活力。
3.8 各组NCOR1 mRNA和蛋白相对表达： 与BG相比，MG中NCOR1 mRNA表达水平显著降低（p?=?0.002）。与MG相比，LDG、MDG和HDG中NCOR1 mRNA表达随药物浓度增加逐渐恢复，呈剂量依赖性趋势，HDG与BG之间无显著差异（p?>?0.05）。NCOR1蛋白表达趋势与mRNA结果一致：与BG相比，MG中NCOR1蛋白表达显著下调（p?=?0.003）；与MG相比，LDG、MDG和HDG中NCOR1蛋白表达逐渐升高，呈明显剂量依赖性效应，HDG与BG之间无显著差异（p?>?0.05）。表明SND可剂量依赖性地逆转LPS诱导的NCOR1表达下调。
四、讨论总结与研究结论
讨论部分指出，AS是一种与心血管疾病密切相关的慢性炎症性疾病，巨噬细胞在AS发病中发挥关键作用。SND通过抑制IL-6和TNF-α等促炎细胞因子表达、升高IL-10水平，抑制M1型巨噬细胞极化并促进M2型极化，从而减轻AS相关炎症损伤。在线粒体自噬方面，SND显著调节LC3、Parkin、P62和FUNDC1的表达水平并恢复线粒体功能，OCR升高表明有氧代谢改善，ECAR降低表明糖酵解活性降低，提示SND有助于恢复巨噬细胞的正常能量代谢。MTS结果显示SND可显著增强LPS刺激后巨噬细胞的活力。qPCR和Western blot结果共同证实，LPS显著抑制巨噬细胞中NCOR1的基因转录和蛋白表达，而SND含药血清以剂量依赖性方式逆转了这一抑制作用。结合线粒体自噬相关蛋白表达的改变，研究人员推测SND对巨噬细胞极化和炎症的调节作用可能与NCOR1通路相关。然而，由于缺乏线粒体自噬通量检测和NCOR1基因干预实验，尚不能确认SND通过上调NCOR1调控线粒体自噬来发挥抗炎和稳定斑块的作用，且本研究仅进行了体外细胞实验，无法直接推断其在体内对稳定动脉粥样硬化斑块的实际效果。
研究结论为：本研究建立了LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，在细胞水平探讨了SND含药血清对巨噬细胞极化、线粒体自噬和线粒体代谢的调控作用，并初步观察了其对NCOR1 mRNA和蛋白表达的影响。体外结果表明，SND含药血清剂量依赖性地抑制巨噬细胞的促炎反应，促进向M2抗炎表型极化，改善异常线粒体自噬和线粒体功能，同时上调NCOR1表达。这些细胞学发现提示SND具有干预动脉粥样硬化相关炎症的潜在作用，且该调节作用可能与NCOR1相关。上述细胞学证据揭示了SND在干预动脉粥样硬化相关炎症病变中的潜在价值，但仍需进一步建立具有完整斑块结构的体内动物模型和获取临床标本，以验证SND是否能在血管内发挥稳定斑块的作用。本研究为后续深入研究SND的抗动脉粥样硬化作用提供了体外分子实验证据。
