《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Biocontrol potential of Bacillus strain AC810 against
Phytophthora nicotianae-associated sisal zebra stripe disease
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摘要黄麻斑马纹病，与Phytophthora nicotianae相关，仍然是黄麻生产的主要制约因素，有效的微生物生物防治候选菌株仍然有限。本研究从中国海南红树林根际沉积物中分离到的菌株AC810出发，利用拮抗试验、粗提物检测、离体叶片评价和全基因组分析，评估了其对P. ni
摘要
黄麻斑马纹病，与Phytophthora nicotianae相关，仍然是黄麻生产的主要制约因素，有效的微生物生物防治候选菌株仍然有限。本研究从中国海南红树林根际沉积物中分离到的菌株AC810出发，利用拮抗试验、粗提物检测、离体叶片评价和全基因组分析，评估了其对P. nicotianae PB2202的防治潜力。AC810对P. nicotianae PB2202的菌丝生长抑制率达93.00 ± 0.00%，并诱发了菌丝卷曲、异常分枝以及肿胀或增粗等形态异常。其乙酸乙酯粗提物表现出浓度依赖性的抗疫霉活性，终点法推算的表观EC50为24.17 μg/mL。在离体黄麻叶片试验中，AC810降低了病害症状发展程度，在所测试条件下对照药效值为69.87 ± 4.17%。全基因组测序鉴定出一条环状染色体和一条环状质粒。ANI、dDDH和系统基因组分析表明，在所分析的基因组中，RMG6为亲缘关系最近的基因组。基因组挖掘预测出14个生物合成基因簇，涉及脂肽、聚酮、铁载体和肽类抗生素的生物合成，同时具有可能与环境适应性和植物相关适合性相关的功能性状。这些基因组预测提供了可检验的假设，而非已确认的机制。总体而言，研究结果支持将AC810作为具有表型支撑和基因组信息支持的候选菌株，进一步评价其对P. nicotianae相关黄麻斑马纹病的防治作用。
引言
黄麻（Agave sisalana）是热带和亚热带地区重要的纤维作物，但其生产受到黄麻斑马纹病的严重制约。该病害造成特征性的叶片病斑，威胁受影响种植园的黄麻生产。在受影响的种植园中，该病害与Phytophthora nicotianae相关[1]。P. nicotianae是一种寄主范围广泛的卵菌病原，其防控受到潮湿环境有利于病害发生、环境中的持久性存活以及单一病害防治措施持久性有限等因素的制约[2]、[3]、[4]。因此，针对该病害系统的实用生物防治候选菌株不仅需要能在琼脂平板上抑制病原菌，还应在黄麻组织上抑制目标病原、减轻病害症状，并能在明确的基因组和功能背景下进行解释。因此，解决黄麻斑马纹病问题需要候选菌株评价将病原抑制、离体叶片症状减轻和基因组信息解读相联系，而非仅依赖常规拮抗筛选。
微生物生物防治开发中一个持续存在的障碍是体外拮抗与宿主植物上病害减轻之间的差距[5]、[6]、[7]。这一差距对于与疫霉属相关病害尤为重要，因为平板试验无法完全反映宿主组织入侵、湿度依赖性病害发展以及病原、宿主组织和候选拮抗菌之间的胞外相互作用。Bacillus属及相关类群是最被广泛研究的细菌生物防治类群之一，其病害防治潜力、环境耐受性和生物合成能力均有大量证据支持[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。其生物防治相关性通常与脂肽、聚酮、铁载体、肽类抗生素、胞外酶以及其他与病原抑制或植物相关适合性相关的性状有关[9]、[11]、[12]、[13]、[14]。已有多项研究报道了抑制疫霉属病害的菌株，包括涉及P. nicotianae、P. sojae以及疫霉属引起的根腐病的病害系统[15]、[16]、[17]。然而，许多研究仍仅强调评价链中的某一环节，如平板抑制、代谢物预测、基因组挖掘或单一试验条件下的病害减轻。对于黄麻斑马纹病，在同一研究中同时具备强抗P. nicotianae活性、离体叶片症状减轻、基因组解析的 taxonomy 定位和谨慎的功能解读的候选菌株证据仍然有限。这一差距限制了为后续机制和应用导向验证确定优先菌株的能力。
为解决这一差距，本研究聚焦于菌株AC810，这是一种源自红树林根际、与Bacillus属相关的分离菌株，经选定用于针对与黄麻斑马纹病相关的P. nicotianae PB2202进一步评价。生境来源本身无法确立生物防治潜力；候选菌株必须在与病害相关的试验中接受评价。因此，本研究将AC810视为一个以目标病原为导向、需要表型、离体叶片和基因组水平评价的候选菌株，而非一般的环培分离菌株。相应地，本研究设计旨在确定AC810对P. nicotianae的拮抗表型能否得到发酵提物活性和离体叶片症状减轻的支持，同时利用全基因组分析提供分类学解析和解读其生物合成与功能潜力的框架。
在本研究中，我们将基于平板的拮抗试验、发酵提物检测和离体叶片病害评价与全基因组测序、系统基因组分类学定位、基于antiSMASH的生物合成基因簇预测以及非BGC功能注释相结合[18]。这一设计使我们能够从三个相互关联的证据层面评价AC810：病原抑制、黄麻组织症状减轻和基因组信息支持的功能潜力。通过整合这些证据层面，我们旨在评估AC810作为进一步抗疫霉评价候选的潜力，并定义可在后续代谢物、基因功能、定殖和温室研究中进行检验的基因组特征。
章节摘要
菌株、病原菌及培养条件
菌株AC810于2023年7月从中国海南省三亚市青梅港红树林自然保护区（东经109°37′12.00″，北纬18°13′8.40″）收集的红树林根际沉积物中分离获得。根际沉积物取自表层20 cm，于冰上运输至实验室，在无菌条件下风干后均质化，再进行依赖培养的培养分离。原始分离流程采用了八种选择性培养基。接种平板在28°C下培养1–4周，
AC810强烈抑制Phytophthora nicotianae PB2202并减轻离体黄麻叶片病害症状
在专注于黄麻斑马纹病病原之前，为评估AC810的拮抗特性，我们首先测试了其对抗12种其他代表性植物病原菌的活性（图1；表1）。12种测试病原菌中有10种的定量终点抑制率得以保留。对于Neoscytalidium dimidiatum PC-78和Fusarium graminearum PH-1，其菌落生长在病原对照和AC810处理中均达到平板边界，无法可靠地进行基于直径的测量，
讨论
本研究将AC810定位为一种具有表型支撑和基因组信息支持的候选菌株，用于进一步评价其对Phytophthora nicotianae相关黄麻斑马纹病的防治作用。这一评价基于多条互补的证据线，而非仅依赖基因组挖掘或体外拮抗。AC810通过目标病原抑制、发酵提物活性、离体黄麻叶片症状减轻、基于基因组的分类学定位以及注释支持的
结论
本研究确立了菌株AC810作为具有表型支撑和基因组信息支持的候选菌株，用于进一步评价其对Phytophthora nicotianae相关黄麻斑马纹病的防治作用。其意义在于多条互补证据线的汇聚，包括对目标病原的强烈抑制、可提取的抗疫霉活性、离体黄麻叶片症状发展减轻、基于基因组的分类学解析以及注释支持的功能潜力。
作者贡献声明
辛怡亨：调查、验证。石浩东：方法论、调查、可视化。喻正霖：验证、调查。袁文昕：方法论、形式分析、验证、调查、数据整理、撰写——初稿。郑志成：方法论、验证、调查。冯惠民：概念化、撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取。徐晓雄：概念化、形式分析、可视化、项目
数据可用性
菌株AC810的全基因组鸟枪法测序项目已提交至DDBJ/ENA/GenBank，登录号为JBYWKK000000000。本文描述的版本为JBYWKK010000000。原始Illumina和PacBio测序读段已提交至NCBI序列读段存档库，BioProject登录号为PRJNA1470136，BioSample登录号为SAMN60397571，读段登录号分别为SRR40900375（Illumina NovaSeq X Plus）和SRR40900374（PacBio Revio）。16S rRNA基因序列
利益冲突声明
作者声明，不存在已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
基金资助
本研究受海南热带海洋学院科研基金（编号：RHDRC202338）、海南省自然科学基金（编号：424RC525）、琼台师范学院重点研究项目（编号：qtky202401）和琼台师范学院科研基金（编号：30030007040）资助。资助方未参与研究设计、数据收集、分析与解读、论文撰写或
利益冲突声明
? 作者声明，不存在已知可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
作者感谢热带作物有害生物综合治理重点实验室为本研究提供所用植物病原菌菌株。
袁文昕|郑志成|石浩东|喻正霖|辛怡亨|徐晓雄|姜芳艳|冯惠民
海南热带海洋学院三亚热带植物分子育种重点实验室，中国海南三亚 572022
