樟疫菌病的发展与嫁接和非嫁接抗疫霉病鳄梨砧木中的生理及维管束变化相关

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Laurel wilt disease development linked to physiological and vascular changes in grafted and non-grafted Phytophthora-tolerant avocado rootstocks

　　

## 摘要

桂疫病菌（*Harringtonia lauricola*）引起的番桂枯萎病是一种致死性维管束病害，已严重影响了佛罗里达州的鳄梨（牛油果）生产。先前的研究表明，对番桂枯萎病的易感性与水木质部导管解剖结构、树液流动特征以及病原体在寄主内部的移动有关。然而，大多数研究均在对嫁接鳄梨树或嫁接在实生砧木上的树上进行，对于非嫁接、无性繁殖的商业砧木或这些砧木与" Hass "品种（全球最主要的商业接穗品种）嫁接后的反应知之甚少。本研究评估了三种常用的抗疫霉根腐病（PRR）砧木——'Dusa'、'Duke 7'和'Toro Canyon'——在未嫁接或与'Hass'接穗嫁接的情况下，接种*H. lauricola*后的病害发展、生理响应、树液流动及木质部解剖结构变化。非嫁接砧木显示出较低的病害严重程度，叶片气体交换减少50%，但木质部树液流动未受影响。接种病原菌的嫁接树则发展出较高的病害严重程度，叶片气体交换严重降低，树液流动减少。尽管嫁接树症状发展相对迅速，但非嫁接树和嫁接树各砧木间的木质部导管数量、大小和导管堵塞率均无显著差异。这些结果表明，在非嫁接抗PRR砧木中，番桂枯萎病的感染速率缓慢，并支持了木质部解剖结构和水分传输特性影响因番桂枯萎病导致树木衰退的假设。嫁接树观察到的相对较高易感性表明，仅木质部解剖结构和木质部树液流动不能完全解释病害结果。此外，接穗-砧木相互作用是影响番桂枯萎病易感性的另一因素。

## 1. 引言

目前，全球鳄梨（*Persea americana* Mill.）产量超过1000万吨，全球市场价值超过150亿美元[1]。消费者对这种富含营养的水果需求迅速增长。墨西哥、哥伦比亚、秘鲁、美国和智利等西半球主要生产国在满足全球市场需求方面发挥着关键作用。然而，由真菌病原体*Harringtonia lauricola*引起的番桂枯萎病对这种经济作物构成了严重威胁。这种毁灭性的维管束病害仅侵染樟科成员，迄今仅在佛罗里达州发现侵染鳄梨树[2][3]。然而，该病害有可能扩散至全美国及西半球其他国家[4]。

番桂枯萎病由多种传播真菌的树木甲虫传播[5][6][7][8]。甲虫利用视觉和嗅觉线索探测寄主树木，然后蛀入木材并引入真菌[9][10]。树木感染后会引发强烈的防御反应，导致快速萎蔫和死亡，通常在一个月内完成[11]。

针对鳄梨树番桂枯萎病的防治工作包括理解寄主抗性机制和鉴定抗性或耐病品种。尽管迄今测试的所有鳄梨品种均易感番桂枯萎病，但树木衰退速率与鳄梨种或品种间的基因型差异有关[12]。鳄梨根据地理起源中心分为三个植物种或生态型：危地马拉型（G）、墨西哥型（M）和西印度型（WI，起源于危地马拉低地地区，后被带入西印度群岛）[13][14]。研究表明，WI生态型非嫁接品种因番桂枯萎病导致的树木衰退比G型或M型非嫁接品种更为迅速[15]。这部分归因于WI型鳄梨具有较大的木质部导管、较高的树液流速（使真菌分生孢子快速通过树木传输），以及在感染*H. lauricola*后更多的木质部导管堵塞（由于导管内形成侵填体或胶状物）[15][16][17]。然而，嫁接植物的易感性因接穗/砧木组合不同而异[12][18]。

由卵菌*Phytophthora cinnamomi*引起的疫霉根腐病（PRR）是大多数鳄梨种植区的主要病害[19][20]。管理PRR的一种常见策略是使用耐病的无性繁殖砧木，以增强树木在感染土壤中的存活率。被最广泛采用的抗PRR砧木为'Duke-7'、'Dusa'和'Toro Canyon'[21]。尽管这些砧木在抗PRR方面已被广泛研究，但它们对番桂枯萎病的易感性——无论作为非嫁接树还是与'Hass'嫁接（'Hass'为全球最主要的商业品种，占世界鳄梨产量的80%）[21]——在很大程度上仍未被探索。这一知识空白对于制定管理策略以最大限度减少番桂枯萎病在使用抗PRR砧木地区的危害至关重要。在一项初步实验中，Duke-7（M型）作为接穗或砧木均在减轻番桂枯萎病症状方面显示出潜力[18]，但这需要进一步研究。

本研究的目的是调查三种最常用的抗PRR砧木——'Dusa'、'Duke-7'和'Toro Canyon'——对番桂枯萎病的易感性。通过检查番桂枯萎病对这些砧木（非嫁接及与'Hass'接穗嫁接）的生理和解剖影响。本研究旨在提供有助于选择具有增强番桂枯萎病韧性的砧木-接穗组合的见解。

## 2. 材料与方法

### 2.1. 植物材料及实验设置

本研究包括两个实验。第一个实验使用两年生的非嫁接无性繁殖'Duke 7'、'Dusa'和'Toro Canyon'砧木。第二个实验中，这些无性繁殖砧木与'Hass'接穗进行嫁接。嫁接树在本研究开始时为三年生。所有树木均购自Brokaw苗圃（加利福尼亚州文图拉），并重新盆栽于装满商业盆栽介质（ProMix?，Premier Tech，加拿大魁北克）的18.9升塑料盆中。

两个实验均在佛罗里达大学热带研究与教育中心温室中进行。温室内的空气温度和相对湿度在每次实验期间使用HOBO Pro v2数据记录仪（Onset Computer Corp., Bourne, MA, USA）记录，记录仪安装在树冠顶部上方约1米处。在非嫁接树实验期间，温室内平均日空气温度范围为20至26°C，平均值为24°C，相对湿度（RH）范围为56%至92%，平均值为70%。在嫁接树实验期间，温室内平均日空气温度范围为16.9至33.5°C，平均值为23.1°C，相对湿度范围为30.3%至100%，平均值为82.7%。在两个实验中，植物均接受约80%的环境光合光子通量（PPF）。

在每次实验中，每个砧木的六株树被分配至两种处理之一：接种或对照。接种树接种总共100 μL的去离子水悬浮的*H. lauricola*分生孢子悬浮液（分离株RL4，保存于荷兰乌得勒支CBS真菌生物多样性中心的标本CBS 127349）；每株树接收总共30,000个分生孢子。为使除引入病原体外的所有条件在接种病原菌和对照树之间保持一致，并考虑接种操作可能造成的伤口效应，对照树接种100 μL去离子水。接种操作由Castillo-Argaez等人[22]先前描述。简要说明，在茎干上钻四个孔（直径2毫米，深度4毫米），在茎干周围等距间隔排列，在非嫁接树中距土面约5厘米处，在嫁接树中距土面10厘米处（避开嫁接结合部）。每个开口注入25 μL去离子水溶液或*H. lauricola*悬浮液。每次实验包括36株树，代表每个非嫁接或嫁接砧木品种每种处理的六次重复。非嫁接树实验持续48天，在之前的实验中使用相同分生孢子悬浮液接种的其他盆栽鳄梨品种出现严重症状后两周结束（B. Schaffer，个人观察）。嫁接树实验在第28天结束，此时某些砧木/接穗组合的树木（重复）出现了严重症状（超过80%的树冠显示症状），无法再采集生理数据。

### 2.2. 病害严重程度评估

每次实验中，使用Ploetz等人[12]概述的1至10分视觉量表每日监测病害严重程度。评分基于受叶片萎蔫、坏死、枯死和茎变色影响的树冠百分比。该量表区分无症状植物（评分 = 1）、八个逐渐增加的严重程度级别的局部树冠损伤（评分2-9，涵盖1-99%的受损树冠）以及完全树冠损伤（评分 = 10）。实验结束时，在接种点上方2厘米和30厘米处以及所有树木的茎顶端采集茎样品，并按照Ploetz等人[12]描述的方法接种于选择性琼脂培养基上，以验证*H. lauricola*的存在或缺失。

### 2.3. 生理变量

叶片气体交换测量包括净CO?同化（A）、水汽气孔导度（gs）和蒸腾作用（Tr）。叶片气体交换使用便携式气体分析仪（CIRAS-3, PP Systems, Amesbury, MA, USA）测量，方法如Castillo-Argaez等人[18]所述。

叶片叶绿素指数（LCI）使用SPAD计（型号502, Minolta, Inc., 日本大阪）在叶片上表面测量。叶绿素荧光使用便携式荧光仪（型号OS-30p, Opti-Sciences Inc., 新罕布什尔州哈德逊）在每株树的两片暗适应叶片的上表面测量。光系统II的最大量子效率（可变叶绿素荧光与最大叶绿素荧光的比值；Fv/Fm）在每株树上记录。所有生理测量在每株树的一片完全展开、近期成熟的叶片上进行，时间在上午9点至12点之间，以避免gs的中午凹陷。在非嫁接树实验中，叶片气体交换、Fv/Fm和LCI测量在接种前一天[接种后-1天（DAI）]及接种后每2-4天间隔进行。在嫁接树实验中，这些测量在接种前一天及之后每周一次直至实验结束。

木质部树液流动在每次实验中连续使用Dynagage 32-1 K树液流动系统连接CR1000数据记录仪测量（Dynamax inc, 德克萨斯州休斯顿, USA），方法如Castillo-Argaez等人[15]所述。数据以10分钟间隔采集，树液流速使用考虑热量散失的质量平衡方程计算[23][24]。

### 2.4. 木质部解剖

在非嫁接树实验中，按照Castillo-Argaez等人[18]的方法，在接种点上方5、30和60厘米处从每个品种的3株接种植物和3株对照植物采集3厘米长的茎段。简要说明，样品用3%多聚甲醛磷酸盐溶液（pH 6.8）固定，然后在0.1 M Sorensen磷酸盐缓冲液中冲洗三次，每次1小时，再手工切割横向组织样品。所有样品用0.1 M醋酸钠（pH 4）中的0.05%甲基百里香酚蓝O（TBO）染色3分钟[25]。组织样品使用1:1去离子水和甘油溶液封片。样品使用复合显微镜（ML 2000, Meiji Techno, 日本）观察和拍摄，并连接数码相机（MC170HD, Leica Microsystems Wentzler, 德国）。

在嫁接树实验中，在嫁接结合部下方5厘米处（砧木部分）和接穗上接种点上方三个位置（5、30和60厘米）从每株植物采集3厘米长的茎段。样品使用0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中的4%甲醛和1%多聚甲醛溶液在室温下固定。茎在固定液中保存至少48小时，然后在0.1 M磷酸钠缓冲液中冲洗三次。之后，茎段在水中水合24小时，使用滑动切片机切片。每个茎段的15个切片（厚度60 μm）用水溶液中pH 4.4的0.05%甲基百里香酚蓝O染色[25]，并使用1:1去离子水和甘油作为封片介质。使用配备数码相机（DFC 500, Leica Microsystems, Wentzler, 德国）的明场显微镜（DMR-HC, Leica Microsystems Wentzler, 德国）进行观察。

在每次实验中，使用400倍放大观察木质部导管数量和大小，仅使用对照树的样品。导管堵塞百分比使用200倍放大观察，仅使用*H. lauricola*接种树的样品。

血管阻塞率在两个实验中均按 Scholz 等 [26] 的方法进行计算。

2.5 解剖图像分析

在未嫁接树实验中，使用 ImageJ 1.59p 软件（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）手动描绘血管，以确定血管大小、密度和阻塞情况。

在嫁接树实验中，为减少手动描绘血管所需的过量时间并提供更快速的定量方法，采用基于图像分割方法的深度学习 U-Net 架构模型来确定木质部导管面积和导管阻塞情况。该方法的详细描述见补充材料（附录 S1）。简要说明如下：共收集了 896 张鳄梨木质部组织的显微照片。从该数据集中随机选取 176 张图像用于模型训练和验证。木质部导管的真实分割掩膜由人工标注完成。图像分辨率经过标准化处理，并使用显微照片中附带的参考比例尺（100 μm = 313 像素）进行比例校准，得到每像素 0.319 μm 的转换比例。木质部导管大小（μm2）采用 U-Net 卷积神经网络架构 [27] 进行测定，该架构在生物医学图像分析中得到广泛应用。该模型被训练为将每个像素分类为"导管"或"背景"，生成二值分割掩膜。模型性能使用交并比（IoU）、Dice 相似系数（DSC）和准确率指标进行评估。在验证数据集上，训练后的网络平均 IoU 为 0.71，DSC 为 0.83，准确率为 0.96。随后使用 OpenCV 对分割图像进行处理，通过 findContours 函数提取导管边界。从二值掩膜中提取轮廓，并使用 contourArea 函数计算每个检测到的导管面积 [28]、[29]。像素面积通过校准比例转换为 μm2。最终标注完成的显微照片保存了导管轮廓和标识符，定量结果导出为包含基于像素和基于微米两种测量的 CSV 文件，用于进一步的统计分析。

2.6 统计分析

每个实验均采用完全随机设计。使用因子（双因素）方差分析评估不同砧木与处理（接种或对照）之间的统计交互作用。使用单因素重复测量方差分析检验处理之间（接种与对照）以及砧木之间随时间的差异（适用于所有响应变量）。砧木之间的差异通过单因素方差分析后接 Tukey's HSD 检验确定。在分析之前，对可见病害症状评分进行了对数转换标准化。对木质部导管阻塞比例在分析前进行了反正弦转换标准化。所有统计分析均使用 SAS 统计软件完成（9.4 版，SAS 研究院，美国北卡罗来纳州凯里）。

3. 结果

3.1 未嫁接抗疫霉根腐病克隆砧木实验

病害严重度方面，处理与砧木之间存在显著的统计交互作用（P ≤ 0.05）（补充表 S1）。接种处理之间也存在显著差异（P ≤ 0.05，补充表 S1）。接种 H. lauricola 的树木在接种后约两到三周出现病害症状，且砧木之间存在显著差异（补充表 S1）；"Duke 7"和"Dusa"的平均病害症状严重度评分为 2，"Toro Canyon"为 1.5（不到一半接种植物出现症状）。对照树木未出现症状（图 1）。接种或非接种的未嫁接砧木之间未观察到统计学差异（P > 0.05）。实验结束时，在所有接种树木中均确认存在 H. lauricola，而对照树木中均未发现。

下载：下载高分辨率图像（387KB）下载：下载全尺寸图像
图 1. 三种克隆未嫁接抗疫霉根腐病鳄梨砧木"Duke 7"、"Dusa"和"Toro Canyon"的桂疫病病害症状严重度进展，采用视觉等级评估（1 = 无症状，10 = 100% 萎蔫/枯死冠层）。两种处理为：接种去离子水的对照和接种 H. lauricola 的桂疫病处理。星号表示由重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值代表均值 ± 标准误。

接种 H. lauricola 的树木与对照相比，叶片气体交换表现出中度下降。所有气体交换变量（A、gs 和 Tr）在处理与未嫁接砧木之间均检测到显著的统计交互作用（P ≤ 0.05）（补充表 S1）。在接种后 5 天，接种树木的砧木之间净光合速率 A 存在显著差异（P ≤ 0.05），"Toro Canyon"的数值显著高于"Dusa"，但不高于"Duke"。实验结束时，大多数接种树木的 A 与对照树木相比下降了约 40 至 50%（图 2）。然而，"Duke 7"的接种树木与对照处理之间未观察到统计学显著差异，除接种后 23 天和 44 天外。在"Dusa"中，接种后 26 天起至实验结束，处理之间 A 存在显著差异。在"Toro Canyon"树木中，接种树木的 A 仅在实验结束前的几天显著低于对照树木。与对照相比，接种树木的气孔导度略有降低（图 2）。在三个品种中，只有"Dusa"的接种树木自接种后 26 天起持续表现出比对照树木更低的气孔导度，而"Duke 7"和"Toro Canyon"仅在少数几个测定日期上接种树木的 gs 显著低于未接种树木。接种树木的砧木之间气孔导度差异仅在接种后 2 天和 5 天显著（P ≤ 0.05），此时"Toro Canyon"的数值显著高于"Dusa"，但不高于"Duke"。与对照处理相比，接种处理的蒸腾速率随时间下降（图 2），与 gs 的模式相似（从接种后 29 天至 47 天出现下降）。

下载：下载高分辨率图像（698KB）下载：下载全尺寸图像
图 2. 三种克隆未嫁接抗疫霉根腐病鳄梨砧木"Duke 7"、"Dusa"和"Toro Canyon"的净 CO? 同化速率（A）、气孔导度（gs）和蒸腾速率（Tr），比较两种处理：接种去离子水的对照和接种 H. lauricola 的桂疫病处理。星号表示由重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值代表均值 ± 标准误。

处理与砧木品种之间在 Fv/Fm 上没有显著交互作用（P > 0.05）（补充表 S1）。然而，接种树木的平均 Fv/Fm 显著低于对照处理（P ≤ 0.05，图 3）。在对照树木中，砧木对 Fv/Fm 的影响仅在接种后 3 天和 14 天显著，这两天"Duke"的数值高于"Dusa"但不高于"Toro Canyon"（P ≤ 0.05）。在接种处理中，未嫁接砧木之间 Fv/Fm 未观察到统计学显著差异（P > 0.5）。叶片叶绿素指数（LCI）在处理与未嫁接砧木品种之间存在显著的统计交互作用（P ≤ 0.05）（补充表 S1）。接种的"Duke 7"和"Dusa"树木的 LCI 随时间显著下降（图 3），但接种的"Toro Canyon"树木的 LCI 与对照相似。对照处理中，未嫁接砧木品种之间的 LCI 显著差异仅在接种后 27 天观察到（P ≤ 0.05），此时"Duke"的 LCI 显著高于"Dusa"但不高于"Toro Canyon"。接种处理中仅在接种后 37 天和 41 天观察到砧木差异（P ≤ 0.05），此时"Duke"的 LCI 显著高于"Toro Canyon"但不高于"Dusa"。

下载：下载高分辨率图像（584KB）下载：下载全尺寸图像
图 3. 抗疫霉根腐病鳄梨砧木"Duke 7"、"Dusa"和"Toro Canyon"的叶片叶绿素指数（LCI）和可变荧光与最大荧光之比（Fv/Fm），比较两种处理：接种去离子水的对照和接种 H. lauricola 的桂疫病处理。星号表示由重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值代表均值 ± 标准误。

木质部蒸腾流速率在处理和未嫁接砧木品种之间存在显著交互作用（P ≤ 0.05）（补充表 S1）；然而，"Duke 7"在接种后 3、42 和 47 天，以及"Dusa"在接种后 47 天之外，处理之间的蒸腾流相似（图 4）。对照处理中，未嫁接砧木之间的蒸腾流显著差异（P ≤ 0.05）仅在接种后 41 天观察到，此时"Dusa"的蒸腾流速率高于"Toro Canyon"但不高于"Duke 7"。接种处理中仅在接种后 21 天和 25 天观察到砧木之间的差异，此时"Duke 7"和"Dusa"的蒸腾流速率显著高于"Toro Canyon"（P ≤ 0.05）。

下载：下载高分辨率图像（620KB）下载：下载全尺寸图像
图 4. 三种克隆未嫁接抗疫霉根腐病鳄梨砧木"Duke 7"、"Dusa"和"Toro Canyon"的每日木质部蒸腾流速率，比较两种处理：接种去离子水的对照和接种 H. lauricola 的桂疫病处理。星号表示由重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值代表均值 ± 标准误。

三种未嫁接克隆砧木品种之间的木质部导管大小和导管总数相似（P > 0.05，表 1）。木质部导管大小约为 2062 至 2405 μm2（面积），导管总数平均为 43。砧木之间木质部导管阻塞比例无显著差异（P > 0.05，表 1），且仅 10% 至 20% 的导管被阻塞。我们在对照树木中观察到少量阻塞导管，很可能是接种去离子水过程中造成的损伤所致。

表 1. 接种 H. lauricola 的抗疫霉根腐病鳄梨砧木的木质部导管大小、数量和阻塞情况，分别为未嫁接（实验 1）或嫁接种苗"Hass"（实验 2）。

空白单元格 | 木质部导管大小（面积 μm2）| 导管数量 | 木质部导管阻塞（%）
实验 1：未嫁接抗疫霉根腐病克隆砧木
"Duke 7" | 2062.33 ± 166.55a | 43.63 ± 2.66a | 14.22 ± 5.11a
"Dusa" | 2404.99 ± 249.54a | 42.76 ± 5.30a | 22.12 ± 5.17a
"Toro Canyon" | 2245.92 ± 178.34a | 43.74 ± 3.26a | 13.07 ± 3.41a
实验 2：嫁接抗疫霉根腐病克隆砧木
"Hass"/"Duke 7" | 2755.06 ± 440.08a | 42.08 ± 9.52a | 6.35 ± 3.47a
"Hass"/"Dusa" | 3240.87 ± 377.36a | 40.00 ± 8.81a | 6.44 ± 2.35a
"Hass"/"Toro Canyon" | 2516.45 ± 127.51a | 45.62 ± 4.93a | 6.67 ± 2.84a

数值为均值 ± 标准误。同一实验中同一列内不同字母表示通过单因素方差分析后接 Tukey's HSD 检验确定的砧木或接穗/砧木组合之间的显著差异（P ≤ 0.05）。

3.2 嫁接种苗"Hass"的抗疫霉根腐病克隆砧木

病害严重度在处理与接穗/砧木组合之间观察到统计交互作用（P ≤ 0.05）（补充表 S2）。在接种树木中，桂疫病症状在接种后第 16 至 22 天之间出现。"Hass"/"Duke 7"和"Hass"/"Dusa"的平均病害严重度评分约为 5，"Hass"/"Toro Canyon"为 7（图 5）；对照树木未显示症状。在所有接种树木中确认存在 H. lauricola，而在对照树木中均未发现。对于接种树木，仅在接种后 20 天时接穗/砧木组合之间存在显著差异，此时"Hass"/"Toro Canyon"的病害评分高于"Hass"/"Duke 7"，但不高于"Hass"/"Dusa"（P ≤ 0.05）。

下载：下载高分辨率图像（352KB）下载：下载全尺寸图像
图 5. 嫁接种在抗疫霉根腐病鳄梨砧木"Duke 7"、"Dusa"或"Toro Canyon"上的"Hass"鳄梨接穗的桂疫病病害症状进展，采用视觉等级评估（1 = 无症状，10 = 100% 萎蔫/枯死冠层）。两种处理为：接种去离子水的对照和接种 H. lauricola 的桂疫病处理。星号表示由重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值代表均值 ± 标准误。

对于所有接穗/砧木组合，接种树木与对照处理相比，叶片气体交换表现出严重下降。所有叶片气体交换变量在处理与接穗/砧木组合之间不存在显著的统计交互作用（P > 0.05）（补充表 S2）。因此，对每个接穗/砧木组合单独分析处理对叶片气体交换的影响。实验结束时，接种树木的净光合速率 A 与对照相比下降了约 80 至 90%（图 6）。从接种后约 11 天起，所有接穗/砧木组合的处理之间观察到统计学显著差异（P ≤ 0.05）。所有接种树木的气孔导度与对照相比大幅降低（P ≤ 0.05），且实验结束时"Hass"/"Toro Canyon"的 gs 完全停止（图 6）。同样，所有接种树木的 Tr 与对照树木相比随时间下降（P ≤ 0.05），其中"Hass"/"Toro Canyon"的下降最为剧烈（图 6）。

下载：下载高分辨率图像（695KB）下载：下载全尺寸图像
图 6. 嫁接种在抗疫霉根腐病鳄梨砧木"Duke 7"、"Dusa"或"Toro Canyon"上的"Hass"鳄梨接穗的净 CO? 同化速率（A）、气孔导度（gs）和蒸腾速率（Tr），比较两种处理：接种去离子水的对照和接种 H. lauricola 的桂疫病处理。星号表示由重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。

数值表示均值±标准误。对于LCI（叶片叶绿素指数），处理与砧木/接穗组合之间不存在显著的统计学交互作用（P > 0.05）（补充表S2）。接种'哈斯'/'Duke 7'的LCI随时间略有下降，与对照组相比（图7），而'哈斯'/'Dusa'和'哈斯'/'Toro Canyon'的LCI与对照组保持相似水平。对于Fv/Fm，处理与砧木/接穗组合之间同样不存在显著的统计学交互作用（P > 0.05）（补充表S2）。与对照组相比，接种的'哈斯'/'Toro Canyon'树木在16 DAI（接种后天数）开始，其平均Fv/Fm显著降低（P ≤ 0.05）（图7）。相反，在接种的'哈斯'/'Dusa'和'哈斯'/'Duke 7'中，Fv/Fm与对照树木相似，仅在16 DAI时'哈斯'/'Duke 7'出现例外（图7）。

图7. 嫁接在抗疫霉根腐病（Phytophthora root rot）抗性鳄梨砧木'Duke 7'、'Dusa'或'Toro Canyon'上的'哈斯'鳄梨接穗的叶片叶绿素指数（LCI）以及可变光合荧光与最大光合荧光之比（Fv/Fm）。两种处理为：对照组接种去离子水和月桂萎蔫病处理组接种Harringtonia lauricola。星号表示通过重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值表示均值±标准误。

对于木质部汁液流动，处理与砧木/接穗组合之间存在显著的统计学交互作用（P ≤ 0.05）（补充表S2）。接种的'哈斯'/'Dusa'和'哈斯'/'Toro Canyon'树木的汁液流动速率显著低于对照组（P ≤ 0.05），但'哈斯'/'Duke 7'在各处理间的木质部汁液流动速率无显著差异（P > 0.05）（图8）。在对照组中，不同砧木/接穗组合之间的木质部汁液流动无显著差异（P > 0.05）。在接种处理组中，仅在26 DAI时不同砧木/接穗组合之间存在显著差异，此时'哈斯'/'Toro Canyon'和'哈斯'/'Dusa'的汁液流动速率显著高于'哈斯'/'Duke 7'（P ≤ 0.05）。

图8. 嫁接在抗疫霉根腐病抗性鳄梨砧木'Duke 7'、'Dusa'或'Toro Canyon'上的'哈斯'鳄梨接穗的日木质部汁液流动速率。两种处理为：对照组接种去离子水和月桂萎蔫病处理组接种Harringtonia lauricola。星号表示通过重复测量方差分析确定的处理间显著差异（P ≤ 0.05）。数值表示均值±标准误。

木质部导管大小和导管总数在三种砧木/接穗组合之间相似（P > 0.05，表1）。木质部导管大小约为2516至3240 μm2（面积），导管总数平均为43条。不同砧木之间木质部导管阻塞百分比无显著差异（P > 0.05，表1），阻塞比例均低于6%。

## 4. 讨论

本研究表明，三种广泛种植的抗疫霉根腐病（Phytophthora root rot）抗性鳄梨砧木'Duke 7'、'Dusa'和'Toro Canyon'在以非嫁接树形式种植时，对月桂萎蔫病表现出一定程度的耐受性（症状发展缓慢）。在整个实验过程中，接种Harringtonia lauricola的非嫁接树木症状和病害严重程度保持相对较低。接种病原体的树木在约18 DAI时首次出现病害症状，感染树木表现出延长的绿色萎蔫期，特征为叶片失去膨压但叶丛保留了大部分绿色。观察到一定程度的落叶，尤其在'Toro Canyon'中更为明显，但棕色萎蔫（坏死或叶片干燥），这是月桂萎蔫病感染的典型症状，仍然较为有限。这些反应与之前使用其他克隆非嫁接WI、G和M×G品种的对照温室实验结果形成对比，后者中症状发展更早（<14 DAI）且进展更快[15]。

非嫁接抗PRR砧木中观察到的相对较低的病害严重程度伴随有较轻微的生理障碍。叶片气体交换仅下降40至50%，而汁液流动基本不受影响。同样，木质部导管阻塞也较为有限，仅影响10至20%的木质部导管。这与感染月桂萎蔫病的嫁接和非嫁接鳄梨树木的其他研究结果形成对比，后者通常表现出更大的气体交换下降，甚至报告数值接近于零[15]、[16]、[21]、[30]。本研究中观察到的非嫁接树木的轻微症状表明，'Dusa'、'Duke 7'和'Toro Canyon'尽管主要被选育为抗Phytophthora cinnamomi的品种，但仍具有一定的月桂萎蔫病耐受性。已有报道表明，墨西哥和墨西哥×危地马拉血统的鳄梨种质资源中具有一定的月桂萎蔫病耐受性[12]。例如，'Colin V-33'（M×G，广泛用作接穗或中间砧）的开放授粉半同胞实生苗已被鉴定为对月桂萎蔫病具有耐受性，而'Colinmex'（M×G）和'Bladimiro M-06'（M）等品种则据报道具有中等耐受性[31]。

综合来看，我们的结果表明，尽管病原体成功定殖，非嫁接砧木的水力功能在很大程度上得以维持。Harringtonia lauricola定殖木质部，引发树木宿主的防御反应，包括木栓形成、凝胶和其他堵塞物的形成，以限制病原体的移动[32]，但同时增加了植物的水力阻力。因此，病害严重程度不仅反映了植物防御的迅速响应，还反映了导管堵塞之间最佳平衡的生理权衡。堵塞不足会导致病原体扩散，而过度堵塞则限制了木质部水分运输并加速水力功能障碍。本研究中观察到的有限导管堵塞表明，这些抗PRR砧木比高度感病的鳄梨品种更能有效地维持这一平衡。水力运输的维持很可能是非嫁接树木接种H. lauricola后叶片气体交换仅出现中等程度下降的原因。此外，气孔导度和蒸腾作用协调下降的观察结果与水力限制一致，而非光合机构的损伤，接种树木中Fv/Fm的轻微下降进一步支持了这一观点，表明光系统II在整个实验过程中基本保持功能。因此，这表明在H. lauricola感染的非嫁接抗PRR砧木中，碳固定主要受到气孔和水力约束的限制，而非光化学损伤的影响，这是维管病害中常见的模式[33]。

在嫁接树实验中，树冠症状出现更早、进展更快，大多数树木在28 DAI时发展为严重症状（图5）。生理测量指标也表明接种树木存在显著障碍。净CO?同化降低约80至90%，伴随近完全的叶气孔关闭、蒸腾作用严重下降和汁液流动显著减少。这些反应与此前报道的受月桂萎蔫病影响的感病鳄梨品种类似[16]、[18]、[30]。综合来看，这些发现表明接穗的感病性对植物的感染反应产生了强烈影响，通过造成水力功能障碍，转化为水分运输减少，限制碳获取，可能进一步损害植物防御和维护功能。

先前的研究提出，鳄梨品种间月桂萎蔫病感病性的差异与木质部解剖结构和水力功能的变异有关；具有固有更大木质部导管和更高汁液流动速率的鳄梨树木对月桂萎蔫病更敏感，因为这有利于真菌传播体的快速移动[15]、[16]。这一关系在非嫁接抗PRR砧木中表现得尤为明显，具有大量狭窄导管，类似于Castillo-Argaez等人[15]报道的观察结果，即非嫁接西印度品种'Waldin'，其特征为密度较高但相对狭窄的导管和较低的汁液流动速率，发展出较轻微的症状，而墨西哥×危地马拉品种'Nabal'则拥有较少但更宽的导管和更高的汁液流动速率，症状更为严重。本研究中抗PRR嫁接树木表现出大量狭窄导管（与非嫁接树木观察到的相当）以及低于非嫁接树木的汁液流动速率，主要是由于水力不平衡，可能是嫁接的结果[34]、[35]、[36]，但仍表现出更大的生理衰退和病害严重程度。这些发现表明，水力结构本身不能完全解释树内的病害发展。近期为鳄梨接穗/砧木组合提出的类似假说也指出，病害进展的差异无法完全由木质部解剖结构或基因型解释，暗示了导致月桂萎蔫病感染树木衰退的生化因素的参与[18]、[30]。

嫁接通过改变砧木和接穗之间的维管连通性和信号传导，引入了额外的生物学复杂性。嫁接引起解剖结构变化，即使嫁接成功，某些改变仍然可能持续存在，如导管排列和对齐、木质部和水力不连续性[37]，这些可能减少植物水分运输[34]，并可能影响H. lauricola的传播。此外，嫁接结合部不仅作为水力连接通道，还作为植物通讯的通道，因为它在接穗和砧木之间运输激素、代谢物、蛋白质、信使RNA和小RNA，协调植物生长和防御过程[37]、[38]。这些变化可能通过影响病原体移动、宿主信号传导或两者兼而有之地影响病害耐受性或抗性[35]、[38]、[39]。

尽管本研究未检测宿主的代谢防御机制，但嫁接树与非嫁接树之间截然不同的反应表明，'哈斯'接穗的感病性可能部分覆盖了砧木介导的耐受机制。因此，本研究结果表明，感病性不能单独归因于砧木或接穗，而是作为一个整体，源于其整合的遗传学和生理反应。近期对墨西哥和墨西哥×危地马拉鳄梨种质资源的筛选显示，月桂萎蔫病感病性存在广泛的遗传变异，尽管遗传背景相似，某些材料表现出显著更慢的病害进展和更低的最终病害严重程度[31]。此外，近期的分子研究表明，月桂萎蔫病的成功定殖需要H. lauricola进行广泛的代谢适应，包括激活有助于定殖宿主组织的硫获取途径[40]。这些发现表明，病害发展不仅取决于病原体通过木质部的移动，还取决于病原体与宿主建立相容性并克服宿主防御的能力。我们的发现与Navia-Urrutia等人[31]的研究结果相结合，表明墨西哥鳄梨品种中可能存在抗性机制。此外，我们发现的启示超越了单株反应的范围，对果园病害管理可能具有重要意义。月桂萎蔫病主要通过粪金龟子传虫媒介传播；然而，病原体通过自然根嫁接的移动也已被记录在案，并可能有助于果园内的局部病害扩散[20]、[41]。在此我们证明'Duke 7'、'Dusa'和'Toro Canyon'砧木对月桂萎蔫病具有一定的耐受性，并有潜力限制通过根嫁接网络传播月桂萎蔫病，尽管这一可能性仍然具有推测性，因为我们并未测试病原体在根系中的移动和恢复情况。未来研究应着重于鉴定导致非嫁接树与嫁接树之间相反反应的机制。对嫁接结合部进行详细的解剖学表征、水力导度的测量以及嫁接界面上方和下方病原体定殖的定量分析，将有助于阐明嫁接介导的维管连通性变化是否影响病害进展。此外，转录组学、代谢组学和组织化学研究可以确定砧木间的差异是否与增强的防御激活、诱导物感知改变、酚类积累或病原体定殖减少有关。长期的田间评估也是必要的，以确定合适的接穗/砧木组合，以及温室条件下观察到的耐受性在商业生产系统中是否得以保持，在这些系统中环境胁迫、传虫媒介压力和根嫁接传播同时发生。

总之，所评估的抗PRR克隆鳄梨砧木在非嫁接树状态下表现出相对较低的月桂萎蔫病感病性，与既往报道的感病鳄梨品种相比，其症状发展延迟、病害严重程度低，且仅有中等程度的生理障碍。用'哈斯'对这些砧木进行嫁接后，病害严重程度大幅增加，生理衰退加速，表明砧木表现不能脱离接穗独立评估。尽管先前的研究强调了木质部导管尺寸和汁液流动在确定感病性方面的重要性，但本研究的发现表明，这些因素无法解释病害结局。相反，耐受性似乎源于宿主遗传、防御反应、嫁接介导的生理效应和病原体适应之间复杂交互作用的结果。

## CRediT作者贡献声明

Raiza Castillo-Argaeza：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法论，形式化分析，数据整理。

Edwin Antonio Gutierrez-Rodriguez：撰写——审阅与编辑，方法论，调查，数据整理。

Syed Shaham Madni：方法论，形式化分析，数据整理。

Sofia Aumond Kuhn：资源，方法论，数据整理。

Tamara Pastori：资源，方法论，数据整理。

Ana I. Vargas：撰写——审阅与编辑，形式化分析，数据整理。

布鲁斯·谢弗：写作——审阅与编辑、可视化、资源、项目管理、资金获取、形式分析、概念化。
写作过程中生成式人工智能和人工智能辅助技术的声明
在本工作准备期间，作者使用了 Grammarly (2026) 进行拼写和语法检查。
资金
本研究由美国农业部国家食品与农业研究所战略竞争性研究倡议（USDA-NIFA-SCRI）资助，拨款编号为 2015-51181-24257、2020-51181-32198 和 2024-51181-43302。
赖萨·卡斯特罗 - 阿尔盖萨|埃德温·安东尼奥·古铁雷斯 - 罗德里格斯|西德·沙哈姆·马德尼|索菲亚·奥蒙德·库恩|塔马拉·帕斯托里|安娜·I·巴尔加斯|布鲁斯·谢弗
佛罗里达大学食品与农业科学研究所农学系，美国佛罗里达州盖恩斯维尔市迈卡蒂大道 1676 号，迈卡蒂 B 楼 3105B 室，邮编 32611