虫草素调控Nrf2/Hmox1信号通路抑制铁死亡并延缓AKI-CKD进展

《Cell Biochemistry and Function》：Cordycepin Regulates the Nrf2/Hmox1 Signaling Pathway to Inhibit Ferroptosis and Improve AKI-CKD

　　

虫草素（Cordycepin, COR）在多种疾病中发挥药理作用，但其在急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）后组织修复中的作用尚待充分阐明。本研究旨在探讨COR是否延缓急性肾损伤向慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）转化（AKI-CKD），并探索其潜在机制。研究人员采用网络药理学（network pharmacology），利用多个数据库识别铁死亡（ferroptosis）、AKI-CKD与COR之间的共享靶点。进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析，随后开展分子对接（molecular docking）验证。在体内，研究人员在C57Bl/6N小鼠（n = 20）中建立肾脏单侧缺血再灌注（unilateral ischemia–reperfusion, uIRI）小鼠模型，随机分为四组（每组n = 5）：Control、CKD model、COR和CKD + COR。COR（10 mg/kg）或生理盐水每日腹腔注射给药，持续2周。通过苏木精-伊红（H&E）、过碘酸-雪夫（PAS）和Masson染色评估肾脏病理和纤维化；通过血清肌酐（serum creatinine）和蛋白尿（proteinuria）评估肾功能。在体外，用H₂O₂处理HK-2细胞，加或不加COR，并通过CCK-8测定细胞活力（cell viability）。使用Nrf2抑制剂（Nrf2 inhibitor）ML385验证通路参与。通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）测定谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶1（Hmox1）的mRNA和蛋白水平。网络药理学交叉分析在459个COR相关基因、843个AKI-CKD相关基因和1866个铁死亡相关基因中鉴定出42个共同靶点。蛋白-蛋白相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络分析提示肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素6（IL6）和Hmox1为关键靶点。富集分析表明其参与铁稳态和氧化应激反应。分子对接显示COR与Nrf2和Hmox1强结合（–8.5和–6.7 kcal/mol）。在体内，模型小鼠表现出血清肌酐和蛋白尿升高、严重肾小管损伤及纤维化增加，COR均显著改善。在体外，H₂O₂降低HK-2细胞活力，下调GPX4、Nrf2和Hmox1，并上调ACSL4；COR逆转这些效应并改善细胞存活。ML385部分阻断COR的保护和调控效应，证实Nrf2/Hmox1通路依赖性。研究人员的发现表明，COR通过激活Nrf2/Hmox1信号通路抑制铁死亡，从而减轻肾损伤和纤维化并减缓AKI-CKD进展。

研究背景方面，急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）是临床常见危重综合征，以血清肌酐、尿素氮等含氮代谢物蓄积及肾小球滤过率短期急剧下降为特征；慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）全球患病率约9.1%，而AKI是加速CKD发生的重要危险因素。AKI向CKD转化（AKI-CKD）涉及细胞器功能障碍、细胞衰老及持续炎症反应，最终导致肾小管间质纤维化。目前临床除肾脏替代治疗外，缺乏可有效阻止该进程的特异性治疗。肾小管上皮细胞持续损伤是关键病理特征，铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性调节性细胞死亡）参与其中，其特征为细胞内脂质过氧化物代谢失衡、活性氧（ROS）蓄积及线粒体损伤。Nrf2/Hmox1信号通路是维持氧化还原稳态的重要防御系统，AKI-CKD恶化时该通路常受损。虫草素（Cordycepin, COR）是从冬虫夏草中分离的天然核苷类似物（3′-脱氧腺苷），具抗炎、抗氧化、抗纤维化、免疫调节及器官保护作用；但其是否调控铁死亡并依赖Nrf2/Hmox1尚未系统研究。基于此，研究人员采用计算预测与实验验证相结合的策略，探讨COR是否通过激活Nrf2/Hmox1抑制铁死亡，从而减轻肾损伤和纤维化、延缓AKI-CKD进展，并揭示其机制及治疗潜力。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员用网络药理学（network pharmacology）从PubChem、BATMAN、CTD、GeneCards和OMIM检索并取交集，经Venny获得42个共同靶点，以STRING 12.0构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，DAVID进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集，Cytoscape 3.9.1可视化，AutoDock Vina和PyMOL完成分子对接。体内采用雄性C57BL/6N小鼠（8–12周）建立45 min单侧缺血再灌注（uIRI）模型，14天终点，COR 10 mg/kg每日腹腔注射，检测血清肌酐、蛋白尿、H&E/PAS/Masson、qRT-PCR、Western blot及Fe²⁺。体外用HK-2细胞，150 μmol/L H₂O₂ 72 h，COR 40 μmol/L，ML385 1 μmol/L，CCK-8测活力。

研究结果：3.1 网络药理学预测与靶点识别：通过网络药理学筛选获得459个COR相关靶点、843个AKI-CKD相关靶点和1866个铁死亡相关靶点，交叉分析得到42个共同靶点；PPI网络含42个节点和480条边，筛选出16个核心基因，包括IL6、TNF、TP53和Hmox1；GO富集涉及IL-6/IL-1β产生、一氧化氮生物合成正调控及脂多糖反应等炎症和应激过程，KEGG富集提示转录调控、泛素化修饰和抗氧化反应，提示COR可能通过免疫和炎症反应发挥作用。

3.2 计算机预测与分子对接：通过“成分-靶点-通路”网络及分子对接预测，TP53、TNF、IL6和Hmox1等核心靶点紧密关联；Hmox1作为Nrf2通路关键下游效应分子显著富集，提示COR可能经Nrf2/Hmox1轴抑制铁死亡；分子对接显示COR与Nrf2和Hmox1的结合能分别为–8.5和–6.7 kcal/mol，提示强结合亲和力。

3.3 COR通过GPX4/ACSL4轴在体内抑制铁死亡：在uIRI诱导的AKI-CKD小鼠模型中，模型组血清肌酐和蛋白尿升高，COR显著降低（p < 0.01）；H&E和PAS显示模型组肾小管空泡变性、刷状缘丢失和管型形成，COR明显改善并降低损伤评分（p < 0.01）；Masson显示模型组间质纤维化明显，COR有效预防（p < 0.01）；qRT-PCR显示Fn1、α-SMA、Col1a1、Col3a1和TGF-β在模型组升高，COR降低其表达；模型组肾组织Fe²⁺升高，COR逆转（p < 0.05）；Western blot显示模型组GPX4降低、ACSL4升高，COR逆转（p < 0.05）。结论为COR通过调节GPX4/ACSL4平衡抑制铁死亡。

3.4 COR保护HK-2细胞对抗H₂O₂诱导的氧化应激：体外实验确定150 μmol/L H₂O₂处理72 h使HK-2细胞活力约降至50%，40 μmol/L COR显著逆转活力下降；Western blot和qRT-PCR显示H₂O₂导致GPX4降低、ACSL4升高并伴随Nrf2/Hmox1表达变化，COR上调GPX4、Nrf2和Hmox1并下调ACSL4，改善细胞存活，提示COR通过激活Nrf2/Hmox1、调控GPX4/ACSL4抑制铁死亡。

3.5 COR经Nrf2/Hmox1通路减轻H₂O₂诱导的HK-2细胞损伤：使用Nrf2抑制剂ML385共处理后，COR诱导的Nrf2和Hmox1蛋白及mRNA上调被显著逆转（p < 0.05），COR对GPX4上调和ACSL4下调的调控几乎被完全消除（p < 0.05），说明COR主要依赖Nrf2通路激活调控铁死亡相关分子。

讨论部分总结指出，AKI与CKD存在明确因果关系，AKI-CKD转化涉及肾小管上皮细胞衰老、适应性修复失败、微血管稀疏和持续低度炎症等复杂机制；Nrf2/Hmox1在维持氧化还原稳态及抗肾纤维化中重要。既往研究多关注COR在急性肾损伤或肾毒性模型中的保护作用，并涉及KLF15-FTH1、p38/JNK及PGK1-ALOX12等机制，但COR是否经Nrf2/Hmox1调控铁死亡尚未充分回答。本研究构建了网络药理学与分子对接预测、体内uIRI模型和体外H₂O₂-HK-2模型验证及ML385功能缺失实验的证据链，提出“COR-Nrf2/Hmox1-铁死亡”轴。讨论同时指出局限：缺乏新鲜肾组织脂质过氧化和动态铁的直接实时检测、无Nrf2敲除动物、H₂O₂模型不能完全模拟缺血性AKI微环境、未探讨铁死亡与其他细胞死亡通路交互、仅使用雄性小鼠、尚需药代动力学和长期疗效毒性评估。

研究结论翻译：本研究首次系统证明COR激活Nrf2/Hmox1通路，上调GPX4并下调ACSL4，从而抑制肾小管上皮细胞铁死亡，该结论得到网络药理学、体内和体外证据支持。ML385功能缺失实验进一步证实COR的抗铁死亡和肾脏保护作用依赖Nrf2/Hmox1。这些发现揭示COR减缓AKI-CKD进展的新机制，并为肾病治疗靶向铁死亡提供理论基础。COR可能因此被开发为调节Nrf2/Hmox1轴以延缓肾病进展的治疗药物。