《ChemBioChem》：Vitamin B12-Functionalized Nanogels for pH-, and Redox-Responsive Doxorubicin Delivery
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快速增殖的癌细胞对维生素B12表现出升高的需求，这使得这种细菌来源的辅因子成为纳米治疗药物递送中极具吸引力的靶向基序。本研究报道了一种简洁的两步合成法，用于制备可聚合的5′-修饰维生素B12单体，从而能够将B12共价整合到pH和氧化还原响应性纳米凝胶中。所得
快速增殖的癌细胞对维生素B12表现出升高的需求，这使得这种细菌来源的辅因子成为纳米治疗药物递送中极具吸引力的靶向基序。本研究报道了一种简洁的两步合成法，用于制备可聚合的5′-修饰维生素B12单体，从而能够将B12共价整合到pH和氧化还原响应性纳米凝胶中。所得纳米凝胶通过阳离子药物与阴离子纳米凝胶网络之间的静电相互作用高效封装多柔比星，同时在肿瘤相关条件下实现刺激响应性药物释放。体外研究表明，DOX@B12-纳米凝胶对HT-29结直肠癌细胞保持有效的抗增殖活性（IC50 = 0.878 ± 0.102 μM），同时对健康CCD 841 CoN细胞的细胞毒性相较于未功能化B12的对照纳米凝胶降低了34倍。这些发现证实了共价工程化维生素B12-纳米凝胶作为选择性及刺激响应性抗癌药物递送的 promising 平台。
## 论文解读文章
**研究背景与现存问题**
癌症治疗的主要手段包括手术、化疗和放疗。其中，化疗因其广泛应用和显著疗效，在临床治疗中占据重要地位。然而，传统的非靶向化疗存在诸多局限，如严重的全身性副作用和高复发率。为克服这些缺点，靶向治疗策略致力于利用纳米或微米级药物载体将药物直接递送至肿瘤部位。脂质体、聚合物胶束、脂质和水凝胶等先驱药物载体系统已显示出更高的精确性和有效性，部分已上市或处于临床试验阶段。
在靶向递送系统中，水凝胶及其纳米/微米形态（即纳米凝胶/微凝胶）因其高含水量、多孔性、保护药物免于血液中降解、降低全身毒性、提高药物溶解度等优势而备受关注。尽管纳米凝胶技术已取得进展，但设计能实现安全可控药物释放的纳米凝胶仍具挑战。目前的研究聚焦于开发能响应肿瘤微环境内源性或外源性刺激（如酶、pH、活性氧、谷胱甘肽、三磷酸腺苷、热、磁、超声、光）的智能纳米凝胶。多刺激响应性纳米凝胶虽显示出优于单一响应系统的药物释放性能，但往往缺乏肿瘤选择性，主要依赖实体瘤的高通透性和滞留效应（EPR）。此外，抗体或叶酸功能化纳米凝胶也存在穿透实体瘤受限、溶解度差和潜在毒性等问题。
**研究目的与意义**
维生素B12因其必需的生物学作用及通过转钴胺素蛋白II（TCII）转运系统介导的受体特异性摄取机制，成为极具吸引力的靶向分子。快速增殖的细胞对B12的需求增加，且在5′-核糖位置进行修饰可保留TCII识别所需的关键结构特征。尽管B12潜力巨大，但用于共价整合到聚合物网络中的可聚合B12衍生物此前未见报道。过往方法多依赖非共价相互作用或与钴中心的配位，可能存在稳定性有限和配体取代反应不可控的问题。因此，本研究旨在开发一种可聚合的B12单体，通过自由基共聚将其共价整合到pH和氧化还原响应性纳米凝胶中，实现对多柔比星的靶向递送，为构建兼具肿瘤选择性和刺激响应性的抗癌药物递送平台提供新策略。
**主要技术方法**
研究人员采用两步合成法制备了在5′-核糖位点修饰的可聚合维生素B12单体，首先引入聚乙二醇连接基，再连接丙烯酰胺官能团。该单体与N-异丙基丙烯酰胺（NIPA）、丙烯酸（AA）及含二硫键的交联剂N,N′-双（丙烯酰）胱胺（BAC）通过自由基共聚合成B12功能化纳米凝胶，并制备不含B12的对照纳米凝胶。通过紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱、透射电子显微镜、动态光散射等技术对纳米凝胶进行表征。体外药物释放和细胞毒性实验分别在模拟肿瘤微环境（酸性pH、高谷胱甘肽浓度）和HT-29结直肠癌细胞及CCD 841 CoN健康细胞系中进行。
**研究结果**
**B12单体的合成与表征**：通过LC-MS、UV-vis和1H-NMR确认了B12单体的成功合成及其纯度。
**B12纳米凝胶的制备与表征**：UV-vis光谱显示B12几乎定量（约92%）掺入聚合物网络。FTIR光谱中，B12纳米凝胶在1625 cm?1处缺乏乙烯基信号，证实B12靶向基团通过共价键嵌入聚合物网络。电子显微镜显示均一的球形形态，约50 nm，EDS能谱显示钴元素在纳米凝胶中分布。DLS测定水合动力学直径约为102和119 nm，PDI分别为0.11和0.23。
**刺激响应性研究**：B12纳米凝胶的体积相变温度（VPTT）为40°C，比对照凝胶高5°C。两种纳米凝胶的zeta电位在pH 4.5附近发生显著转变，对应羧酸基团的pKa。在pH 2.4、温度超过30°C时，凝胶发生聚集；在较高pH下，羧酸基团电离导致静电排斥增强和凝胶溶胀。在谷胱甘肽（GSH）存在下，二硫键被裂解，纳米凝胶降解为更小碎片。
**药物装载与释放**：多柔比星通过静电相互作用装载于纳米凝胶中，B12纳米凝胶的药物装载量为10%，包封效率为70%。在pH 7.4无GSH条件下，药物释放率低（约18%）；在pH 5.0条件下释放率升至50%；在pH 5.0和40 mM GSH条件下，释放率进一步显著提高至75%。
**体外细胞毒性研究**：DOX@B12纳米凝胶对HT-29结直肠癌细胞保持有效的抗增殖活性（IC50 = 0.878 ± 0.102 μM），但对健康CCD 841 CoN细胞的毒性显著降低（1 μM DOX时约90%细胞存活率，IC50约30 μM）。相比之下，非B12功能化的对照纳米凝胶对CCD 841 CoN细胞毒性更高（1 μM DOX时约65%存活率，IC50约20 μM），表明B12功能化增强了纳米凝胶区分癌细胞与健康细胞的能力。
**讨论与结论**
DOX@B12纳米凝胶的刺激响应性释放特性与肿瘤细胞内微环境（低pH和高GSH）高度匹配，有利于实现药物的靶向和可控释放。对癌细胞和健康细胞毒性的差异表明B12功能化对细胞相互作用的贡献，使纳米凝胶能够选择性靶向B12需求旺盛的癌细胞。尽管研究未直接评估TCII介导的摄取机制，但观察到的选择性毒性趋势与B12相关贡献一致。
本研究成功开发了将维生素B12共价整合到pH和氧化还原响应性纳米凝胶中的策略，所得纳米凝胶能高效装载多柔比星，并在模拟肿瘤微环境条件下实现刺激响应性释放。体外实验证实，DOX@B12纳米凝胶对结直肠癌细胞保持强效抗增殖活性，同时显著降低对健康细胞的毒性。这些发现凸显了共价工程化维生素B12纳米凝胶作为肿瘤靶向和刺激响应性抗癌药物递送多功能平台的潜力。
