含环丙基酰肼衍生物的设计、合成及其对植物病原真菌的抗真菌构效关系研究

《Chemistry & Biodiversity》：Design, Synthesis, and Antifungal Structure-Activity Relationship of Hydrazide Derivatives Containing a Cyclopropyl Group Against Phytopathogenic Fungi

　　

为发现具有独特骨架的新型抗真菌剂用于作物保护，研究人员设计、合成并评估了一系列23个含环丙基的酰肼衍生物（其中包括14个新化学实体）对8种植物病原真菌的抗真菌活性。50 μg/mL下的体外生物测定结果显示，大多数目标化合物表现出中等至优异的抗真菌活性。值得注意的是，三个化合物（4、6、7）表现出最强效的广谱活性，对全部8种供试真菌的抑制率为95.0%–100.0%。其对大多数真菌的半数有效浓度（EC50）值低于10 μg/mL。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，母体化合物1引起链格孢（A. alternata）菌丝显著的形态学改变，包括皱缩、塌陷和不规则扭曲，为该系列化合物的细胞效应提供了初步指示。化合物1与琥珀酸脱氢酶（SDH）的分子对接生成了一个合理的结合模型，提示SDH可能是该系列化合物的潜在候选靶点，有待直接酶学验证。构效关系（SAR）分析表明，苯环始终与高活性相关，且对位卤素取代有利于增强抗真菌活性。这些发现表明，含环丙基的酰肼衍生物，特别是化合物4、6和7，是开发新型抗真菌剂的有前景的先导候选化合物。

含环丙基酰肼衍生物的抗真菌研究：从分子设计到作用机制初探

一、研究背景与科学问题

植物病原真菌是农作物病害的主要病原体，据估计高达80%的植物病害由其引起，每年在全球范围内造成约2000亿美元的经济损失。部分植物病原真菌在侵染作物过程中还会分泌毒素和有害代谢产物，例如强致癌物黄曲霉毒素B1，进而引发食品安全问题。尽管生物防治、抗病品种选育及生物农药应用等多种策略已被探索，化学杀菌剂仍是控制植物病原真菌最有效的手段。然而，化学杀菌剂的过度和重复使用导致真菌抗药性问题日益严重，同时部分杀菌剂对人类、有益昆虫和微生物具有潜在危害，且因降解缓慢而影响环境。因此，开发新型抗真菌剂具有迫切的现实需求。

酰肼衍生物广泛存在于天然及合成化合物中，是药物和农药研发领域的重要药效团，已展现出杀虫、抗菌、抗真菌、抗癌、抗氧化及酶抑制等多种生物活性。目前已有多款含酰肼结构单元的农药被开发上市，如虫酰肼（Tebufenozide）、噁唑菌酮（Famoxadone）和灭锈胺（Miexiuyihao）等。然而，已有研究中的酰基片段多局限于芳香族羰基，脂肪族酰基部分的影响尚未被探索。环丙烷环作为最小的环烷烃，广泛存在于具有生物活性的合成分子和次级代谢产物中。研究表明，环丙基片段有利于改善药物的内在亲脂性、选择性和代谢稳定性，部分化合物可通过环丙基与靶蛋白结合，从而增强活性并降低脱靶效应。然而，含环丙基羰基片段的酰肼衍生物鲜有报道，其对植物病原真菌的抗真菌活性在很大程度上仍属空白。基于此，研究人员采用分子杂交策略，设计并合成了一系列含环丙基的酰肼衍生物，以探索新型抗真菌剂。

二、研究内容与主要结论

研究人员设计并合成了23个含环丙基的酰肼衍生物，其中14个为新化学实体。合成路线分为两条：化合物1–18通过羰基二咪唑活化的中间体与取代苯肼盐酸盐反应制备；化合物19–23由酰氯与取代苯胺在碱性条件下反应合成。所有化合物结构经核磁共振氢谱（¹H NMR）、核磁共振碳谱（¹³C NMR）和高分辨质谱（HRMS）确证。

体外抗真菌活性测定采用菌丝生长速率法，以50 μg/mL浓度对8种植物病原真菌进行初筛。结果显示，大多数化合物表现出中等至优异的抑制活性。化合物4、6和7表现最为突出，对全部8种供试真菌的抑制率达95.0%–100.0%，其中化合物4几乎对所有供试真菌均呈现100.0%抑制。进一步对15个高活性化合物（1–15）测定半数有效浓度（EC₅₀）值，结果显示大多数化合物的EC₅₀值低于10 μg/mL。化合物4对弯孢霉（C. lunata）的EC₅₀值仅为1.15 μg/mL，远优于两种阳性对照噻菌灵（TBZ）和醚菌酯（KXM）（两者EC₅₀值均大于50 μg/mL）。化合物4和7对链格孢（A. alternata）的EC₅₀值分别为2.10和1.90 μg/mL，约为阳性对照的1/13和1/19。在稻瘟病菌（P. oryzae）测试中，化合物4（EC₅₀ = 3.36 μg/mL）、7（EC₅₀ = 3.50 μg/mL）和6（EC₅₀ = 5.24 μg/mL）均显著优于两种阳性对照。值得注意的是，TBZ和KXM对茄链格孢（A. solani）、链格孢（A. alternata）、弯孢霉（C. lunata）和稻瘟病菌（P. oryzae）的活性较弱，而目标化合物对这些真菌表现出明显优势。

三、主要技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：基于分子杂交策略的化合物设计与合成；菌丝线性生长速率法进行体外抗真菌活性筛选及EC₅₀值测定；扫描电子显微镜（SEM）观察化合物处理后的菌丝形态学变化；分子对接技术（AutoDock Vina 1.2.5）研究化合物与琥珀酸脱氢酶（SDH，PDB编号：2FBW）的结合模式。供试病原真菌由西北农林科技大学提供。

四、研究结果

2.3 构效关系分析：基于初筛和EC₅₀测定结果，研究人员总结出四条构效关系规律。第一，直接连接于酰肼氮原子的苯环与高活性密切相关，将苯环替换为苄基（化合物17）或环己基（化合物18）导致活性急剧下降。第二，苯环上取代基类型对抗真菌活性影响显著，卤素取代总体有利，氟代化合物活性最高，依次为氯代和溴代，而碘代导致活性明显降低；强吸电子基团如硝基（16）和三氟甲基（14）则显著降低活性。第三，取代基位置至关重要，对位异构体（4、7、10） consistently 优于邻位对应物，对位是引入活性增强取代基的优选位点。第四，酰肼的N-N连接子对强效活性至关重要，对应的酰胺衍生物（19–23）在所有供试真菌上的活性均显著降低。

2.4 SEM分析：以母体化合物1（3 μg/mL）处理链格孢（A. alternata）菌丝后进行SEM观察。对照组菌丝形态均匀、规则、完整，表面光滑饱满，直径一致，呈直线生长。处理组菌丝出现严重且广泛的形态学改变，表现为表面粗糙、皱缩、不规则褶皱，伴随明显扭曲、缠绕和部分碎裂，部分菌丝扁平塌陷，提示细胞壁结构受损及胞内物质可能泄漏。这些超微结构损伤与化合物1对菌丝生长的抑制作用一致，提示细胞壁完整性和膜稳定性受损。

2.5 分子对接分析：鉴于目标化合物含有与琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHIs）常见的 carboxamide 骨架相似的结构片段，研究人员选择母体化合物1作为代表与SDH进行分子对接。结果显示，化合物1能良好结合于SDH的泛醌结合位点，主要通过三个氢键（Arg469-N，3.23 ?；Arg469-N，3.22 ?；Asn53-O，3.16 ?）、一个π–阳离子相互作用（Arg469，4.11 ?）、一个π–烷基相互作用（Arg218，4.99 ?）及其他范德华力。计算结合能为?6.779 kcal/mol，表明化合物1与SDH具有中等至较强的结合亲和力。由于化合物4、6和7与化合物1共享相同的药效团骨架，仅卤素取代基的类型和位置不同，推测它们可能以相似取向结合SDH，其更高的抗真菌效力可能源于取代基诱导的相互作用调节。需强调的是，对接结果仅为计算预测，SDH作为该系列化合物潜在候选靶点的假设有待直接酶学验证。

五、结论

本研究设计、合成并评估了23个含环丙基的酰肼衍生物对8种植物病原真菌的抗真菌活性。生物测定结果表明，大多数目标化合物在50 μg/mL浓度下表现出中等至优异的抗真菌活性。其中，化合物4（4-F）、6（3-Cl）和7（4-Cl）活性最为突出，对全部供试真菌的抑制率达95.0%–100.0%，对大多数病原菌的EC₅₀值低于10 μg/mL。特别是化合物4对弯孢霉（C. lunata）表现出显著活性，EC₅₀值为1.15 μg/mL，远优于两种阳性对照。SEM观察显示母体化合物1在链格孢（A. alternata）中诱导显著的菌丝形态损伤，为该系列化合物的细胞效应提供了形态学支持。分子对接为SDH作为该化学类别潜在候选靶点提供了结构假说。构效关系分析揭示苯环是高活性的关键结构特征，对位卤素取代是最优修饰策略。总体而言，本研究凸显了含环丙基酰肼衍生物作为新型抗真菌先导化合物的潜力，为进一步结构优化提供了有价值的见解。