基于整合代谢组学与网络药理学的蛇甜瓜（Cucumis melo Var. flexuosus）抗皮肤衰老及抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Integrated Metabolomics and Network Pharmacology Reveal Anti-Aging and Anti-MRSA Activities of Cucumis melo Var. flexuosus

　　

蛇甜瓜（Cucumis melo var. flexuosus）传统上用于皮肤疾病的治疗，然而其植物化学成分组成及生物活性尚未得到充分表征。为此，研究人员系统研究了三个果实基因型（LG、SH和WH）以及LG基因型的叶片（LGLV）。利用液相色谱-高分辨质谱联用技术（LC-HRMS），在所研究的提取物中初步鉴定出100多种植物化学成分。化学计量学工具将样品区分为三个不同的聚类。LGLV聚类以富含黄酮类化合物为特征，LG与SH聚类富含甘油磷脂和溶血磷脂，而WH聚类则富集脑苷脂类化合物。网络药理学揭示，黄酮类化合物、酚酸类及溶血磷脂是抗皮肤衰老和抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的关键植物化学成分。LGLV在不同体外试验中均表现出最高的抗氧化活性。LGLV对MRSA具有最高的抗菌、生物膜抑制（半数抑制浓度IC50 = 0.322 mg/mL）及生物膜剥离活性。抗菌功效通过体内MRSA皮肤感染模型得到验证。此外，在人成纤维细胞体外培养的H2O2诱导衰老模型中，流式细胞术及对基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、白细胞介素-6（IL-6）、p53的有效抑制以及组织金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）水平的升高，均证实LGLV能够阻止细胞衰老进程。上述研究结果表明，叶片是开发生物活性化合物用于抗MRSA及皮肤保护产品的更可持续来源。

论文解读

一、研究背景与研究意义

皮肤衰老是当今社会备受关注的美容与身心健康问题。衰老皮肤表现为表皮变薄、干燥、皮肤屏障功能障碍、修复能力下降、胶原蛋白和弹性蛋白减少，最终导致皮肤弹性丧失和皱纹产生。活性氧（ROS）在皮肤衰老的触发和发展中扮演关键角色。与此同时，衰老皮肤对固有免疫产生负面影响，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）因其广泛传播和抗生素耐药性，已成为全球健康的严峻威胁，可导致葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征、脓疱疮、软组织感染等多种疾病。由于新型抗菌药物研发失败率高、成本高昂，传统草药单独或与常规抗生素联用的策略受到广泛关注。

蛇甜瓜（Cucumis melo var. flexuosus），又称亚美尼亚黄瓜，是葫芦科甜瓜属的多态物种，其果实在地中海和中亚多国作为黄瓜替代品食用。传统上，蛇甜瓜果片被外用于皮肤美白和缓解擦伤，但迄今缺乏科学证据支持其皮肤抗衰老和抗菌活性。本研究旨在系统评估蛇甜瓜提取物在化妆品领域的抗菌和抗衰老潜力，采用多重策略：利用LC-HRMS对不同基因型果实和叶片提取物进行化学表征；运用化学计量学识别不同基因型间的关键成分；评估总酚（TP）和总黄酮（TF）含量及体外抗氧化活性；通过网络药理学阐明关键靶点和关键植物成分；通过体外和体内研究考察抗菌活性；通过体外模型评估抗衰老活性。该研究填补了蛇甜瓜植物化学成分与生物活性表征的空白，为其在功能性化妆品原料开发中的应用提供了科学依据。

二、主要关键技术方法

研究人员采集了埃及贝尼苏韦夫省当地农场的三种蛇甜瓜果实基因型（LG长光滑果、SH短毛果、WH白毛果），LG基因型种子购自埃及开罗的ElKorma集团，并在开罗大学药学院药用、芳香及有毒植物实验站（MAPPE）种植获取叶片。采用70%乙醇对冻干果实和风干叶片进行提取。研究运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UHPLC-ESI-Q-TOF-MS）进行非靶向代谢组学分析；采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进行化学计量学分析；通过Folin-Ciocalteu法和AlCl₃比色法测定总酚和总黄酮含量；采用DPPH、FRAP和β-胡萝卜素-亚油酸三种体外抗氧化试验；利用网络药理学方法（包括GeneCards、DisGeNET、Swiss Target Prediction、STRING、Cytoscape和ShinyGO等数据库和平台）构建化合物-靶点-疾病网络；采用微量肉汤稀释法测定最低杀菌浓度（MBC），结晶紫法评估生物膜抑制和剥离活性；建立小鼠MRSA皮肤感染模型进行体内验证；利用人成纤维细胞（Hfb4）建立H₂O₂诱导衰老模型，通过流式细胞术分析细胞周期，ELISA检测MMP-1、TIMP-1和IL-6水平，实时荧光定量PCR检测p53基因表达。

三、主要研究结果

3.1 LC-HRMS化学表征、比色分析及化学计量学

通过LC-HRMS在叶片和果实样品中初步鉴定出约110个色谱峰。甘油磷脂类为最大化合物类别（32个），其次为酚酸和简单酚类（20个）、脂肪酸（19个）、黄酮类（12个）、氨基酸和胺类（7个）及有机酸（4个）。PCA分析解释了超过80%的样本间方差（PC1为66.8%，PC2为17.6%），PC1区分了叶片与果实，LGLV位于正侧，果实位于负侧；PC2将果实分为两个聚类，SH和LG在一个聚类，WH在另一个聚类。载荷图显示黄酮类化合物（37、38、39、43）为LGLV的特征成分，LG和SH果实以独特的磷脂谱为特征，WH则以大豆脑苷脂为特征。PLS-DA进一步确认了三个聚类，VIP得分显示WH富含磷脂和脂肪酸衍生物，LGLV富含黄酮类化合物。

半定量分析显示，LGLV的总酚含量约为果实的2-4倍，总黄酮含量约为果实的5-3倍。相应地，LGLV在DPPH（约为果实GAE当量的8倍）、FRAP（约为果实IC₅₀的一半）和β-胡萝卜素-亚油酸试验（抑制率比果实高1.3-1.6倍）中均表现出最高的抗氧化活性。果实提取物的抗氧化活性较弱，ANOVA和Tukey事后检验将其归为一组。

3.2 网络药理学研究

网络药理学分析揭示，抗MRSA活性排名靠前的化合物为简单酚酸类或甘油磷脂类，而抗皮肤衰老的关键成分为黄酮苷元及甘油酯类。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示，肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶B（AKT1）和白细胞介素-6（IL-6）可能是抗MRSA的关键靶点，而肿瘤蛋白53（TP53）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）和雌激素受体1（ESR1）可能是抗皮肤衰老的关键靶点。KEGG富集分析表明，提取物可能影响与MRSA感染相关的缺氧（HIF-1）和炎症（TNF）通路，以及皮肤衰老相关的MAPK和PI3K-Akt通路。基因本体（GO）生物学过程分析显示，提取物可能对抗与ROS、氧化应激及外界刺激相关的生物学过程。

3.3 抗MRSA活性评估

各提取物对MRSA USA300表现出显著的抗菌活性。LGLV的最低杀菌浓度（MBC）为5 ± 0.0 mg/mL，LG和SH为20 ± 0.0 mg/mL，WH在所测浓度内未显示杀菌活性。在生物膜抑制试验中，LGLV表现出最高效力，IC₅₀为0.3223 mg/mL；其生物膜剥离活性更为显著，EC₅₀为0.1828 mg/mL，且在低至0.15625 mg/mL的浓度下仍具有显著的生物膜抑制和剥离活性。所有提取物的生物膜剥离活性普遍优于抑制活性，提示提取物可能优先靶向生物膜的结构组分而非初始形成机制。体内小鼠MRSA皮肤感染模型证实，LGLV处理组的细菌载量比阴性对照组和25% DMSO组分别低4.248和4.174个对数单位（p < 0.0001），而DMSO载体组与阴性对照组之间无显著差异。

3.4 体外试验间的相关性分析

总酚（TP）和总黄酮（TF）含量与DPPH、β-胡萝卜素-亚油酸和1/MBC试验呈强正相关，与FRAP和生物膜抑制的1/IC₅₀呈中等正相关。β-胡萝卜素-亚油酸抑制率与剥离IC₅₀呈强负相关。这些结果解释了LGLV因具有最高TP和TF含量而表现出最高的抗MRSA、生物膜抑制和剥离活性。

3.5 抗衰老活性评估

细胞毒性试验显示各提取物的IC₅₀值较大（LG为437.34 ± 5.8 μg/mL，SH为603.38 ± 2.53 μg/mL，LGLV为611.57 ± 1.09 μg/mL，WH为619.02 ± 6.34 μg/mL），表明其潜在安全性。LGLV因具有最高TP、TF含量和最高抗氧化活性而被选作进一步研究。

在H₂O₂诱导的人成纤维细胞衰老模型中，衰老细胞出现显著的G0/G1期细胞周期阻滞（91.29%），LGLV处理后G0/G1期细胞降至75.53%，S期细胞从7.45%增至22.39%，G2/M期细胞从1.25%增至2.05%，与抗坏血酸处理组效果相似。与正常细胞相比，H₂O₂导致IL-6和MMP-1分别显著升高63%和17%，TIMP-1显著降低36%。LGLV处理逆转了这些变化：IL-6和MMP-1分别降低18%和40%，TIMP-1升高125%。此外，LGLV处理组的p53表达较衰老细胞显著降低81%（0.19 vs 1.0，p < 0.0001）。这些结果表明LGLV通过调节MMP/TIMP系统、抑制炎症介质IL-6和下调p53表达来对抗氧化应激诱导的皮肤衰老。

四、讨论与结论

讨论部分指出，基质金属蛋白酶（MMPs）的主要功能是降解细胞外基质（ECM），MMP-1启动I型胶原蛋白的降解。LGLV处理显著增加TIMP-1并降低MMP-1，与已报道的人参籽提取物通过抑制MAPK信号通路降低UV诱导的MMP-1活性、减少胶原降解的研究结果一致。炎症与衰老密切相关，衰老供体来源的真皮成纤维细胞中IL-6 mRNA高表达，而LGLV显著降低了IL-6的产生。网络药理学预测黄酮类和阿魏酸是抗皮肤衰老的关键生物活性化合物，这与已有研究一致——木犀草素和芹菜素通过对抗氧化应激减少炎症介质和MMP-1释放，阿魏酸通过抗炎、抗氧化、抑制MMP和诱导胶原合成发挥抗衰老作用。

研究结论指出，该研究评估了蛇甜瓜作为外用抗菌和抗皮肤衰老剂的传统用途。虽然果实富含溶血磷脂，但LGLV提取物富含黄酮类和酚酸类化合物，因而具有最高的总酚、总黄酮含量和抗氧化活性。网络药理学强调黄酮类和酚酸类分别是抗皮肤衰老和抗MRSA的关键生物活性植物成分。LGLV提取物的抗MRSA功效在体外和体内均得到实验验证，并通过抑制胶原酶MMP-1和炎症介质IL-6来对抗氧化应激诱导的皮肤衰老。LGLV提取物有望成为针对皮肤感染和皮肤衰老的功能性化妆品原料。研究也指出了局限性：缺乏足够的标准品以实现质谱鉴定的置信水平1，未来需进行NMR分析确认主要成分结构；需通过生物活性导向分离考察不同化学类别间的协同作用；应在3D动态皮肤模型和临床研究中评估功效与安全性；需考察LGLV对MRSA基因组和转录组的影响；抗衰老活性应在不同衰老触发因素（如紫外线、晚期糖基化终产物）模型中进一步评估。