Lobelia clavata根总生物碱部位（LCA）通过双重抑制TLR4/NF-κB与PI3K/AKT1/mTOR通路改善卵清蛋白诱导的哮喘小鼠气道炎症：网络药理学与实验验证

《Chemistry & Biodiversity》：The Effect of Total Alkaloid Fraction From the Roots of Lobelia clavata on Airway Inflammation in Asthmatic Mice via Network Pharmacology and Experimental Verification

　　

Lobelia clavata在中国戴药（Dai medicine）中传统用于治疗哮喘；然而，其生物活性成分及潜在机制仍知之甚少。本研究采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的小鼠哮喘模型考察L. clavata根的抗哮喘潜力。通过组织病理学分析、行为观察和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）评估其三种提取物——水提取物（water extract，LCW）、乙醇提取物（ethanolic extract，LCE）和总生物碱部位（total alkaloid fraction，LCA）的治疗作用。其中，LCA表现出最强活性，可有效改善肺损伤并调节细胞因子水平，具体表现为降低白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、转化生长因子-β₁（transforming growth factor-β₁，TGF-β₁）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）水平，同时升高干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平。对LCA的植物化学研究通过色谱、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和质谱（mass spectrometry，MS）分离并鉴定了四种哌啶衍生物。对这四种分离化合物的网络药理学分析确定AKT1和mTOR为关键靶点，并显著富集于PI3K-AKT、Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）和NF-κB通路。分子对接和蛋白免疫印迹（Western blot，WB）分析进一步验证，LCA抑制TLR4、MyD88和总NF-κB的表达，以及PI3K、AKT1、mTOR和NF-κB的磷酸化。综上所述，这些发现表明LCA是L. clavata的主要抗哮喘活性部位，通过双重抑制TLR4/NF-κB和PI3K/AKT1/mTOR信号通路发挥其作用。

研究背景：哮喘是常见的慢性炎症性气道疾病，以反复喘息、咳嗽和胸闷为特征。全球约2.62亿人患病，每年约46.1万例死亡；中国20岁及以上成人哮喘患病率为4.2%，约4570万人，疾病负担显著。现有治疗主要包括β₂受体激动剂、抗胆碱能药、糖皮质激素和白三烯受体拮抗剂等，但气道炎症常持续存在，并可导致不可逆气道重塑和肺功能进行性下降。NF-κB（nuclear factor-κB，核因子-κB）是炎症主调控因子，TLR4（Toll-like receptor 4，Toll样受体4）/MyD88（myeloid differentiation primary response 88，髓样分化初级反应蛋白88）级联为其上游激活通路；PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase，磷脂酰肌醇3-激酶）/AKT1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1）/mTOR（mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）通路参与细胞存活、增殖和炎症反应，且AKT1可直接激活NF-κB，形成协同促炎网络。戴药有长期治疗哮喘的实践；L. clavata根在云南德宏戴医中用于缓解哮喘，但其活性成分和机制不清。此前仅报道该植物中非生物碱成分，未报道生物碱；同属植物含哌啶生物碱。因此，研究人员比较LCW、LCE和LCA，以确定主要活性部位并探索其机制。

研究人员采用OVA诱导的BALB/c小鼠过敏性哮喘模型，以地塞米松（dexamethasone，Dex）为阳性对照，在等剂量100 mg/kg下比较三种提取物，并结合化学成分分离、网络药理学、分子对接和WB验证。结论为LCA是最强抗哮喘活性部位，可减轻肺损伤、调节细胞因子，并通过双重抑制TLR4/NF-κB与PI3K/AKT1/mTOR通路发挥作用。该研究为LCA作为哮喘潜在治疗剂提供了机制基础。

主要关键技术方法：采用雌性BALB/c小鼠（18–20 g，SPF级），购自中国医学科学院医学生物学研究所；建立OVA诱导过敏性哮喘模型，设对照、OVA、Dex（1 mg/kg）及LCW、LCE、LCA（100 mg/kg）组。采用行为观察、肺组织H&E与Masson染色、ELISA检测细胞因子，WB检测通路蛋白。LCA经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、RP-18柱色谱及NMR、MS分离鉴定化合物。整合SwissTargetPrediction、GeneCards/DisGeNET/OMIM、STRING、Cytoscape和Metascape进行网络药理学与富集分析，并以AutoDock Vina开展分子对接。

研究结果：
3.1 LCW、LCE和LCA对小鼠体重、咳嗽症状及肺组织病理的影响：通过OVA模型、行为观察及H&E和Masson染色发现，OVA组体重下降、抓挠头面和蜷缩行为增加、肺泡壁增厚、炎细胞浸润及胶原沉积；LCW未缓解症状，LCE和LCA均减轻哮喘样症状和肺组织病理改变，且LCA优于LCE；Dex亦显著减轻肺组织学改变。
3.2 LCE和LCA抑制肺组织细胞因子表达：ELISA显示，与模型组比较，LCE和LCA降低IL-4、IL-17、LTB4、TGF-β₁和TNF-α水平，升高IFN-γ水平，LCA疗效优于LCE。
3.3 LCA中分离的化合物：经色谱分离及NMR、MS鉴定，从LCA获得四种哌啶衍生物，分别为α-phenyl-2-pyridineethanol (1)、8-ethyl-10-phenyl-3,4-dehydrolobelidiol (2)、N-methyl-2-(2′-hydroxybutyl)-6-(2″-hydroxybutyl)-3-piperidine (3)和norlobelanine (4)。
3.4 网络药理学结果：SwissTargetPrediction预测得271个潜在靶点，GeneCards、OMIM和DisGeNET检索得2258个哮喘相关靶点，交集111个；构建111个节点、871条边的PPI（protein–protein interaction，蛋白-蛋白相互作用）网络，核心靶点包括AKT1、SRC、STAT3、HSP90AA1、EGFR、MAPK3、MMP9、HSP90AB1、MTOR和JAK2；GO和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）富集显示PI3K-AKT、Toll样受体和NF-κB通路显著富集。
3.5 分子对接研究：四种化合物与AKT1、mTOR和NF-κB对接，化合物1呈中等结合，化合物2结合较弱且对mTOR无显著结合，化合物4结合最强，化合物3未显示有效结合，为生物碱与关键靶点相互作用提供结构依据。
3.6 LCA通过调节TLR4/NF-κB和PI3K/AKT1/mTOR信号通路发挥抗哮喘作用：WB显示模型组p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR、NF-κB、p-NF-κB、TLR4和MyD88升高；LCE降低NF-κB、p-NF-κB、TLR4、MyD88及p-AKT1；LCA降低p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR、NF-κB、p-NF-κB、TLR4和MyD88，表明LCA通过抑制两条通路缓解OVA诱导的过敏性哮喘。

讨论部分总结：讨论指出戴药传统使用L. clavata治疗哮喘，但机制不清；OVA模型出现气道壁增厚、肺泡壁增厚、上皮脱落及胶原增生等典型改变。LCW无效，LCE和LCA有效，LCA更优。ELISA结果涉及Th1/Th2失衡、Th17/IL-17、TGF-β₁和LTB4在哮喘炎症中的作用。从LCA分离的哌啶衍生物与lobeline结构相似。网络药理学提示AKT1和mTOR为核心靶点，KEGG富集涉及PI3K-AKT、Toll样受体和NF-κB通路；NF-κB虽未被网络药理学预测为直接靶点，但为下游效应因子，且lobeline有调节NF-κB的报道，故纳入分子对接。研究局限性为植物材料有限，未评估单个单体生物碱的生物活性；后续将扩大采集、分离更多哌啶衍生物，并建立LPS诱导16HBE细胞模型评价抗炎活性及构效关系。

研究结论（翻译）：总之，在L. clavata根三种提取物中，总生物碱部位（LCA）在OVA诱导小鼠哮喘模型中表现出最显著的治疗作用。LCA通过降低LTB4、TGF-β₁、IL-4、TNF-α和IL-17水平并升高IFN-γ水平，有效减轻肺损伤并恢复介质平衡。研究人员从LCA中分离并鉴定四种哌啶衍生物。整合网络药理学、分子对接和实验验证表明，LCA的抗哮喘机制主要涉及抑制PI3K/AKT1/mTOR和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路。总体而言，这些发现为将LCA视为哮喘潜在治疗剂提供了机制基础。