异位病灶消融后小鼠子宫内膜异位症模型中持续性盆腔粘连与纤维化重塑的机制研究

《The FASEB Journal》：Persistent Pelvic Adhesions and Fibrotic Remodeling Following Ectopic Lesion Ablation in a Mouse Model of Endometriosis

　　

子宫内膜异位症是一种慢性、雌激素依赖的炎症性疾病，其特征为异位子宫内膜样病灶、纤维化及持续性盆腔疼痛。尽管异位病灶是疼痛的重要贡献因素，但症状严重程度往往与病灶负荷相关性较差，提示存在不依赖病灶的机制。本研究利用小鼠模型，探讨了异位病灶来源细胞对持续性盆腔粘连、纤维化重塑及子宫内膜异位症相关行为学改变的作用。研究采用同系移植模型结合诱导型白喉毒素受体（inducible diphtheria toxin receptor，iDTR）介导的细胞消融技术，选择性清除供体来源的孕激素受体（progesterone receptor，PGR）表达异位细胞。通过将来自Pgrcre/+Rosa26iDTR/mTmG供体小鼠的子宫组织移植至受体小鼠诱导子宫内膜异位症，随后予以白喉毒素（diphtheria toxin，DT）介导病灶消融。通过影像学、组织学及分子分析评估病灶负荷、盆腔粘连及纤维化重塑，同时采用非诱发行为学实验评估行为学结局。选择性消融消除了可检测的GFP阳性异位病灶。组织学及分子分析表明，与已建立的异位病灶相比，粘连相关组织内胶原沉积及α-SMA阳性纤维化重塑显著减少，但仍高于假手术对照组。然而，尽管病灶已被消融，DT处理组与溶剂处理组小鼠在筑巢及埋珠行为表现上未检测到统计学显著差异，尽管样本量有限可能限制了对部分行为学效应的检测能力。上述发现表明，虽然与已建立的异位病灶相比，粘连相关组织的纤维化有所减轻，但残余纤维化重塑仍高于假手术水平，而行为学结局呈现可变反应，未见显著且一致的逆转，提示除异位病灶外，靶向纤维化及粘连性重塑可能具有重要的治疗意义。

论文解读：异位病灶消融后子宫内膜异位症小鼠模型中盆腔粘连与纤维化重塑的持续性研究

一、研究背景与科学问题

子宫内膜异位症是一种慢性、雌激素依赖的炎症性妇科疾病，以子宫内膜样组织在子宫外生长为特征，常伴随盆腔疼痛、不孕、生活质量下降及显著的社会经济负担。除严重痛经外，患者还面临背痛、头痛、关节痛等其他疼痛状况的风险，并与焦虑、抑郁密切相关，显著影响工作效率和社会功能。

疼痛的产生机制是多因素的。异位病灶可通过占位效应、黏附于肠道等邻近盆腔器官，并通过释放细胞因子、前列腺素和神经营养因子形成促炎微环境，致敏伤害性通路。与此同时，进行性纤维化和粘连形成会扭曲盆腔解剖结构，产生机械性牵拉，并可能涉及疼痛敏感结构，进一步加剧疼痛。然而，粘连与疼痛严重程度之间的关系仍存在争议：部分研究报告粘连程度与疼痛严重程度呈正相关，而另一些研究则未发现显著关联。这种不一致性凸显了人们对病灶相关组织重塑如何参与疼痛产生和维持的认识尚不完整。

目前子宫内膜异位症的一线治疗为激素抑制治疗，包括复方口服避孕药、孕激素和促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）激动剂或拮抗剂。然而，这些疗法并不能根除异位病灶，停药后疾病活动可能持续或复发。值得注意的是，11%–19%的患者在接受药物治疗后疼痛无改善，25%–34%的患者在停药后出现疼痛复发。这些临床观察表明，仅针对病灶活性的治疗可能不足以解释持续性症状，迫切需要识别驱动病灶持续存在、组织重塑和疼痛的细胞及分子机制。

孕激素受体（progesterone receptor，PGR）介导的孕激素信号对子宫内膜稳态至关重要。PGR表达细胞的丢失或失调是子宫内膜异位症的一个标志性特征，并导致在位内膜和异位病灶中的孕激素抵抗，从而促进疾病进展。然而，供体来源的Pgr-谱系异位细胞对已建立病灶维持和相关组织重塑的贡献仍不清楚。

诱导型白喉毒素受体（inducible diphtheria toxin receptor，iDTR）系统能够在白喉毒素（diphtheria toxin，DT）给药后实现对遗传学定义细胞群体的靶向消融。本研究将iDTR系统与同系小鼠子宫内膜异位症模型相结合，在病灶建立后选择性消融供体来源的Pgr-谱系异位细胞，以直接确定消除已建立的异位病灶是否足以解决持续性盆腔粘连、纤维化重塑和子宫内膜异位症相关行为学改变。

二、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：使用Pgr^cre/+Rosa26^iDTR/mTmG转基因小鼠作为子宫组织供体，Cre阴性Rosa26^iDTR/mTmG小鼠作为受体，通过腹腔注射子宫碎片建立同系子宫内膜异位症模型；采用DT介导的诱导型细胞消融技术选择性清除供体来源的PGR表达细胞；运用活体荧光成像系统（AMI HTX）结合Aura Imaging Software进行GFP荧光信号检测与定量分析；采用筑巢实验和埋珠实验两种非诱发行为学实验评估功能性及情感性行为改变；通过标准化0–3分评分系统进行盆腔粘连的宏观评估；运用苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色（MTS）和免疫组织化学（IHC）技术评估组织形态、纤维化及蛋白表达；使用Visiopharm软件结合人工智能算法进行数字化图像分析和H-score定量。

三、研究结果

3.1 DT介导的诱导型消融可高效清除PGR表达子宫内膜细胞

研究人员首先在Pgr^cre/+Rosa26^iDTR/mTmG小鼠中验证了DT介导的诱导型消融效率。小鼠接受两次间隔8小时的DT（100 ng/只/次）或PBS腹腔注射。活体荧光成像显示，DT处理组在24小时和48小时时间点的GFP荧光信号较溶剂对照组显著降低（24小时：0.44±0.08 vs. 1.31±0.14×10⁸，p<0.01；48小时：0.27±0.04 vs. 1.17±0.10×10⁸，p<0.001）。H&E染色显示DT处理组子宫内膜上皮和间质区室显著减少，而肌层保持完整。PGR免疫组织化学定量分析证实，DT处理后24小时和48小时，上皮和间质区室的PGR H-score均显著下降（上皮：3.97±2.21和2.78±1.59；间质：3.38±1.05和9.07±1.90），证明iDTR系统能够高效、快速地消融PGR表达子宫内膜细胞。

3.2 盆腔粘连在异位病灶消融后仍然持续存在

在验证消融效率后，研究人员在已建立子宫内膜异位症的小鼠中评估了病灶消融对行为学结局和盆腔粘连的影响。荧光成像证实DT处理消除了可检测的GFP阳性供体来源异位病灶。筑巢实验结果显示，溶剂处理的子宫内膜异位症小鼠筑巢评分（3.44±0.24）显著低于溶剂处理假手术组（4.67±0.33，p<0.05）和DT处理假手术组（4.83±0.16，p<0.01）。DT处理与溶剂处理的子宫内膜异位症小鼠之间筑巢评分无显著差异（4.33±0.29 vs. 3.44±0.24，p=0.077）。埋珠实验显示，溶剂和DT处理的子宫内膜异位症小鼠埋珠评分（3.28±0.81和4.44±1.07）均显著低于两组假手术对照组，但DT与溶剂处理的内异症小鼠之间无显著差异（p=0.8274）。盆腔粘连半定量评分显示，溶剂处理组（2.33±0.33）和DT处理组（2.00±0.44）均维持高粘连评分，而假手术组均为0分。这些结果表明，异位病灶消融并不能解决已建立的盆腔粘连。

3.3 病灶消融后粘连相关组织中PGR缺失但组织持续存在

免疫组织化学分析显示，假手术子宫间质PGR表达强（177.05±18.31），溶剂处理异位病灶中显著降低（90.91±9.90，p<0.01），DT处理粘连相关组织中进一步降低（8.88±3.89，p<0.001）。上皮PGR在假手术子宫中强表达（261.59±11.40），在异位病灶中显著降低（160.41±9.93，p<0.001）。DT消融后粘连相关组织中无可识别的子宫内膜上皮区室。pSTAT3在溶剂处理异位病灶上皮细胞中显著升高（148.80±15.02 vs. 假手术12.36±5.64，p<0.001），但DT消融后粘连相关组织中无上皮区室可评估。

3.4 粘连相关组织中胶原沉积和α-SMA阳性纤维化重塑持续存在

Masson三色染色定量分析显示，假手术子宫纤维化指数低（1.33±1.30和2.07±2.04），异位病灶中显著升高（162.07±8.07，p<0.001），DT处理后粘连相关组织纤维化指数（95.39±16.16）显著低于异位病灶（p<0.001），但仍显著高于假手术水平。COL1A1表达在异位病灶中最高（92.38±11.30），DT处理后粘连相关组织（46.93±7.02）显著降低（p<0.001），但仍高于假手术水平。α-SMA表达在异位病灶中显著升高（67.05±4.93，p<0.001），DT处理后粘连相关组织（30.78±3.27，p<0.001）仍显著高于假手术对照（3.22±1.64和3.28±1.69），但显著低于异位病灶（p<0.001）。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，DT介导的诱导型消融有效消除了可检测的供体来源Pgr表达异位细胞，但盆腔粘连和粘连相关纤维化重塑仍然持续存在，行为学结局呈现可变反应。研究结果与临床观察一致——病灶定向治疗并不能统一解决子宫内膜异位症相关症状。研究强调，粘连相关组织并非残留的活动性异位病灶，而更可能代表在已建立病灶内及周围发展并在消融后持续存在的纤维化和粘连性组织重塑。然而，这些持续性纤维化细胞的细胞来源尚未确定，可能包括受体来源的成纤维细胞、未被DT靶向的供体来源PGR阴性间质或血管周围细胞，以及参与细胞外基质重塑的免疫细胞。研究还指出，DT介导的消融模型与手术切除有本质区别——DT选择性清除供体来源PGR表达异位细胞而不物理移除周围组织，而手术切除会移除可见病灶及周围纤维化和粘连组织，且手术本身造成的组织损伤可能促进额外的炎症、纤维化和粘连形成。

研究结论为：盆腔粘连和粘连相关纤维化重塑在有效消融可检测的供体来源异位病灶后仍然持续存在，而行为学结局呈现可变反应，未见显著且一致的逆转。这些发现表明，仅靶向异位病灶可能不足以解决已建立的纤维化和粘连性重塑，支持进一步研究在病灶消融后维持这些病理变化的机制。靶向异位病灶和持续性纤维化重塑可能为改善子宫内膜异位症的长期结局提供更有效的策略。