《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：BDH1 Attenuates Macrophage Foam Cell Formation and Inflammation in Atherosclerosis Via Modulating Histone H3K9 Acylation Balance and Activating PPAR Signaling
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β-羟基丁酸脱氢酶1（BDH1）已被发现与代谢性疾病相关。然而，其在动脉粥样硬化（AS）中的功能及潜在机制仍不明确。研究人员建立了高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺陷（ApoE?/?）小鼠模型和氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞模型。通过
β-羟基丁酸脱氢酶1（BDH1）已被发现与代谢性疾病相关。然而，其在动脉粥样硬化（AS）中的功能及潜在机制仍不明确。研究人员建立了高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺陷（ApoE?/?）小鼠模型和氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞模型。通过免疫荧光和蛋白质印迹法（Western blot）评估BDH1的表达。研究人员用MB-3（乙酰化抑制剂）和乙酰辅酶A合酶抑制剂1（ACSS2i，β-羟基丁酰化通路抑制剂）处理BDH1过表达或敲低的RAW264.7细胞。评估了细胞活力、脂质沉积、脂质相关指标、炎症细胞因子和组蛋白修饰。进行了生物信息学分析以筛选BDH1的下游通路，并应用过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）通路抑制剂GW9662进行功能验证。本研究中，BDH1在动脉粥样硬化小鼠的主动脉病变和斑块巨噬细胞中显著下调。在ox-LDL刺激的RAW264.7细胞中，BDH1过表达增加了细胞活力，减少了脂质积累、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及组蛋白H3第9位赖氨酸β-羟基丁酰化（H3K9bhb）水平，同时增加了白细胞介素-10（IL-10）和组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化（H3K9ac）水平。相反，BDH1敲低加剧了这些病理改变。MB-3减弱了BDH1过表达的保护作用及其对H3K9ac的诱导。ACSS2i部分挽救了BDH1敲低的有害效应，伴随H3K9bhb降低和H3K9ac恢复。PPAR通路被鉴定为BDH1的下游通路，且PPAR抑制逆转了BDH1过表达的益处。总之，BDH1通过至少部分调节包括H3K9ac和H3K9bhb在内的组蛋白酰化，并激活PPAR信号通路，从而预防ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞形成和炎症反应。
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是全球血管疾病的主要病理基础，其临床表现包括缺血性卒中、缺血性心脏病和外周动脉疾病，对人类健康构成严重威胁。AS的发生发展由脂质代谢紊乱与动脉壁内慢性免疫炎症反应的持续相互作用驱动，导致脂质沉积、巨噬细胞泡沫细胞形成和动脉壁重塑。尽管以他汀为基础的降脂治疗可有效降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），但仍有大量患者存在残余心血管风险。表观遗传调控，特别是组蛋白翻译后修饰，在AS的发生和进展中起关键作用。近年来，除经典乙酰化外，还发现了多种新型组蛋白酰化修饰，如β-羟基丁酰化、乳酸化等。β-羟基丁酸脱氢酶1（BDH1，酮体代谢的关键限速酶）催化β-羟基丁酸与乙酰乙酸之间的可逆转化，维持酮体稳态。已有研究发现BDH1在糖尿病心肌病、肿瘤等中发挥作用，并可能通过调节组蛋白H3K9β-羟基丁酰化（H3K9bhb）影响基因转录。然而，BDH1在AS中调节组蛋白酰化修饰的具体功能和分子机制仍不清楚。因此，本研究旨在探讨BDH1在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫细胞形成中的作用，以及其是否通过组蛋白酰化修饰和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路调节脂质积累和炎症反应。
研究人员建立了高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺陷（ApoE?/?）小鼠的AS模型和ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫细胞模型。通过免疫荧光和蛋白质印迹法（Western blot）检测BDH1表达，并使用BDH1过表达和敲低技术结合药理学抑制剂，评估了细胞活力、脂质沉积、脂质指标、炎症细胞因子及组蛋白修饰变化。通过生物信息学筛选和功能验证，确定了PPAR信号通路为BDH1的下游通路。结果表明，BDH1在AS小鼠主动脉病变和斑块巨噬细胞中显著下调。BDH1过表达可减轻ox-LDL诱导的细胞活力下降、脂质积累和炎症反应，而敲低则加重这些病理改变。机制上，BDH1通过上调组蛋白H3K9乙酰化（H3K9ac）、下调H3K9bhb，以及激活PPAR信号通路来发挥保护作用。这一研究为深入理解AS的表观遗传机制提供了新见解，提示BDH1可能成为AS的潜在治疗靶点。
在技术方法方面，研究人员采用高脂饮食喂养的ApoE?/?小鼠（购自SPF Biotechnology Co. Ltd）构建AS模型，并以ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞（购自iCell Bioscience）建立泡沫细胞模型。通过免疫荧光和Western blot检测蛋白表达；利用小干扰RNA（siRNA）和过表达质粒进行基因操作；使用CCK-8法检测细胞活力，油红O染色评估脂质沉积，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血脂和炎症因子，实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测mRNA水平。采用MB-3（乙酰化抑制剂）和乙酰辅酶A合酶抑制剂1（ACSS2i，β-羟基丁酰化通路抑制剂）处理细胞以探究酰化修饰的作用。基于GeneCards和CoXPresDB数据库进行生物信息学分析，筛选下游通路，并用GW9662（PPAR抑制剂）进行功能验证。
研究结果部分，首先，在AS小鼠模型的建立与验证中，通过高脂饮食喂养ApoE?/?小鼠，与对照组相比，AS模型组空腹血糖（FBG）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）显著升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）降低；血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）升高，白细胞介素-10（IL-10）降低。油红O染色和H&E染色显示主动脉出现明显脂质沉积和斑块，证实模型成功。其次，在动脉粥样硬化病变中BDH1表达下调方面，Western blot和免疫荧光显示，AS小鼠主动脉组织中BDH1蛋白水平显著低于对照组，且在与巨噬细胞标志物F4/80共定位的斑块巨噬细胞中信号减弱，提示BDH1表达下调与AS相关。第三，在BDH1通过组蛋白酰化修饰调控ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞功能方面，研究人员在ox-LDL刺激的RAW264.7细胞中，通过BDH1过表达和敲低实验发现，BDH1过表达显著增加细胞活力，减少脂质积累和TG、TC水平，升高IL-10、降低TNF-α；同时升高H3K9ac并降低H3K9bhb。相反，BDH1敲低则加重上述病理变化。MB-3处理可逆转BDH1过表达的保护作用及H3K9ac的升高；ACSS2i处理部分逆转了BDH1敲低导致的损伤，伴随H3K9bhb降低和H3K9ac恢复。这些结果表明BDH1通过调节组蛋白酰化平衡发挥功能。第四，在生物信息学筛选确定PPAR信号通路为BDH1的潜在下游靶点方面，通过GeneCards和CoXPresDB数据库获取AS相关基因及BDH1共表达基因，取交集获得490个基因，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示PPAR信号通路显著富集。Western blot验证显示，ox-LDL抑制PPARα和PPARγ表达，而BDH1过表达可逆转这一抑制，GW9662可阻断该逆转。第五，在BDH1通过PPAR信号通路减轻ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤和泡沫细胞形成方面，采用GW9662抑制PPAR通路后，BDH1过表达对细胞活力、脂质沉积、TG/TC、TNF-α和IL-10的改善作用均被部分逆转，表明BDH1的保护作用依赖于PPAR信号通路的激活。
在讨论部分，研究人员指出，组蛋白翻译后修饰在AS的脂质代谢失衡、细胞表型可塑性和炎症反应中具有重要调节作用。既往研究显示了多种组蛋白酰化修饰在AS中的参与。本研究发现BDH1通过上调H3K9ac、下调H3K9bhb来维持组蛋白酰化平衡，从而保护巨噬细胞功能。此外，PPAR家族（包括PPARα和PPARγ）在调节脂质代谢和炎症中发挥关键作用。本研究证实ox-LDL抑制PPARα和PPARγ表达，而BDH1过表达能恢复其水平，且GW9662可逆转BDH1的保护作用，说明BDH1至少部分通过激活PPAR信号通路发挥作用。但研究也存在局限性：所用抑制剂并非位点特异性，不能排除其他组蛋白位点或非组蛋白参与；Western blot只能分析整体修饰水平，无法区分位点特异性变化；动物模型仅限于ApoE?/?小鼠，仍需条件性基因敲除或过表达模型进一步验证。
研究结论（翻译原文）：“总之，本研究提供了强有力的证据，表明BDH1在动脉粥样硬化病变中下调，并且它通过至少部分调节包括H3K9ac和H3K9bhb在内的组蛋白酰化，以及激活PPAR信号通路，有效减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质积累和炎症反应。这些发现不仅增进了对AS表观遗传机制的理解，也为将BDH1作为该疾病有前景的治疗靶点提供了实验依据。未来，研究重点应转向评估BDH1的临床应用可行性和制定针对它的干预策略，从而为AS的防治开辟新途径。”
