新型Schiff碱–缩氨基硫脲杂合体的合成、PC3细胞毒性、凋亡相关mRNA表达、总氧化/抗氧化状态及分子模拟研究

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Synthesis, Cytotoxic Activity, mRNA Expression, Total Oxidant and Antioxidant Status, and Molecular Modeling Studies of Novel Schiff Base–Thiosemicarbazone Hybrids

研究人员合成了多种新型Schiff碱类化合物，并通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（¹H-NMR）、核磁共振碳谱（¹³C-NMR）和高分辨质谱（HRMS）确认了其化学结构。这些化合物在人前列腺癌细胞系（PC3）中测试72 h。结果显示，化合物NZ10、NZ9、NZ7和NZ4对PC3细胞系具有高细胞毒性，IC₅₀值分别为10.54、14.58、15.85和16.48 μM。通过RT-qPCR检测BAX、BID、BCL2和BCL-xL的mRNA表达水平，测试所选化合物对凋亡信号的调节作用。此外，通过测定细胞内总氧化剂和总抗氧化剂水平，检查其对氧化应激水平的影响。结果显示，所选化合物显著上调促凋亡BAX和BID，同时下调抗凋亡BCL2和BCL-xL水平。此外，发现化合物显著增加细胞氧化状态。通过分子对接和分子动力学（MD）模拟评估相对活性化合物与BCL-2的结合潜力。对接研究表明化合物具有与BCL-2结构结合的潜力，但弱于标准药物venetoclax（维奈克拉）。MD模拟分析显示，具有较高亲和力的化合物与BCL-2结构形成的复合物稳定。

研究背景与问题：Schiff碱（含C=N双键的亚胺类化合物，Schiff base）是一类重要化合物，具有抗真菌、解热、抗肿瘤、抗增殖和抗菌等广谱生物活性；其通常由伯胺与醛或酮缩合制备。缩氨基硫脲（thiosemicarbazone，TSC）及其金属配合物也显示抗肿瘤、抗菌和抗真菌等活性，其抗肿瘤活性有报道与顺铂类似。TSC已被广泛研究用于包括癌症在内的多种疾病；含芳酰腙和TSC的“杂合”铁螯合剂对肿瘤细胞显示选择性抗增殖作用；TSC还报道有抗病毒和抗HIV活性，氨基酸类缩氨基硫脲可抑制Vero细胞中的登革病毒感染。肼基硫代甲酰胺衍生物（hydrazinecarbothioamide derivatives，HCTA）常由异硫氰酸酯与酰肼或肼合成，是合成其他骨架的生物活性中间体。4-噻唑烷酮（4-thiazolidinone）环是现代药物化学中用于合理药物设计的重要结构单元，其衍生物具有抗炎、镇痛、抗锥虫、抗惊厥、抗病毒、抗真菌、抗菌和抗癌等活性；2,4-二氧噻唑烷可刺激PPARγ，也有PPARγ非依赖作用，抗癌所需剂量低于降糖所需剂量，并用于帕金森病和阿尔茨海默病等神经疾病治疗。基于作者既往对Schiff碱衍生物合成及生物活性评价的持续研究，本研究设计并合成以Schiff碱为核心、偶联缩氨基硫脲衍生物单元或4-噻唑烷酮环的新型化合物，并对多数合成化合物进行细胞毒活性、RT-qPCR基因表达和抗氧化状态评估。需要解决的问题是：这些新型杂合体是否对前列腺癌PC3细胞具有细胞毒性，是否通过凋亡信号和氧化应激发挥作用，以及相对活性化合物是否具有与BCL-2结合并形成稳定复合物的潜力。研究意义在于为前列腺癌候选分子提供结构-活性信息和机制线索。

研究人员开展了四步合成并获得NZ、YZ、NZA、YZA系列化合物；通过FT-IR、¹H-NMR、¹³C-NMR和HRMS确认结构；在PC3细胞系（人前列腺癌细胞系，PC3）中采用MTT法（噻唑蓝法）测试72 h细胞毒性并计算IC₅₀；用RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链反应，RT-qPCR）检测BAX、BID、BCL2和BCL-xL mRNA表达，以GAPDH为内参并按Livak法计算相对表达；用试剂盒测定总氧化状态（TOS）和总抗氧化状态（TAS）并计算氧化应激指数（OSI）；采用分子对接（Schr?dinger release 2025-3，Glide；BCL-2结构PDB 6O0K）和分子动力学（MD）模拟（GROMACS 2024）评估结合与稳定性。PC3（ATCC CRL-1435）购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，USA）。

研究结果如下。3.1 化学（Chemistry）：通过¹H-NMR、¹³C-NMR、HRMS和FT-IR确认目标前体及目标化合物结构；NMR显示NZ系列硫脲NH、靛红NH及最终NZ的亚甲基和端炔CH特征信号，NZA系列=CH信号，YZA系列端炔和=CH信号，为所提出结构提供结构证据。3.2 抗增殖活性研究（Antiproliferative Activity Studies）：以MTT法评价PC3细胞毒性，NZ1–10的IC₅₀范围为10.54–179.20 μM，活性最高者为NZ10（10.54 μM）、NZ9（14.58 μM）、NZ7（15.85 μM）和NZ4（16.48 μM），提示卤代苯基（2-溴、4-氯、2,6-二氟）提高活性；含4-乙基苯基的NZ9活性高于含萘-1-基的NZ6、含3-甲氧基苯基的NZ5和含4-甲氧基苯基的NZ3。NZA1–10对前列腺癌细胞系大多无活性，但含萘-1-基核心的NZA6活性显著（17.47 μM）。YZ1–10的IC₅₀范围为23.33–115.60 μM，最活跃者为含2,6-二氟苯基的YZ7（23.33 μM）和含2-溴苯基的YZ10（25.08 μM），提示卤代或邻位取代苯基支持活性；YZA1–10总体抗增殖作用低于YZ系列，YZA6、YZA7和YZA9的IC₅₀分别为67.94、85.84和83.91 μM。3.3 基因表达分析（Gene Expression Analysis）：通过RT-qPCR检测PC3细胞中促凋亡BAX和BID及抗凋亡BCL2和BCL-xL的mRNA水平，所有测试化合物显著增加BAX和BID、显著降低BCL2和BCL-xL，并显著降低BCL2/BAX比值，表明凋亡信号被触发并向凋亡方向偏移。3.4 氧化应激分析（Oxidative Stress Analysis）：通过分光光度法测定TOS和TAS并计算OSI，所有测试化合物显著增加PC3细胞总氧化剂含量、降低抗氧化剂含量并提高OSI，表明化合物诱导氧化应激。3.5 分子对接（Molecular Docking）：以venetoclax再对接BCL-2结构（6O0K）验证对接流程，venetoclax与Asp103和Gly145残基相互作用，其中与Gly145形成氢键、与Asp103形成盐桥；活性化合物具有与BCL-2结合的潜力，但能量值均高于共晶venetoclax，提示结合亲和力较低。NZ7和NZA6对接分数相对较低；NZA6仅与Phe104形成π-π堆积，NZ7与Asp103形成氢键并与Tyr108形成π-π堆积，NZA6具有最低Glide能量值。NZ系列活性化合物的oxoindoline环氮上氢参与与BCL-2的氢键，卡硫代酰胺氮所连苯基及其取代基参与结合；NZ5、NZ7和NZ9的苯环与BCL-2形成π-π堆积，NZ1的硝基形成盐桥，NZ4的氯取代基形成卤键；相关相互作用涉及Asp103、Tyr108和Arg146。YZ系列活性化合物的卡硫代酰胺基团氮上氢参与氢键，YZ7与Asp103形成氢键，YZ8和YZ10与Tyr202形成氢键；YZ系列活性化合物相互作用数目相对较少，提示NZ系列活性化合物对BCL-2的结合潜力略高。3.6 MD模拟（MD Simulation）：对NZ7、NZA6和venetoclax与BCL-2的复合物进行MD模拟，骨架RMSD（均方根偏差，RMSD）全程低于0.3 nm；NZ7复合物在30 ns后获得稳定但RMSD较高，NZA6和venetoclax复合物RMSD较低；化合物RMSD显示NZ7较高、NZA6和venetoclax较低且venetoclax更低；Rg（回转半径，Rg）均值约1.47 nm，NZ7和NZA6相似，venetoclax略高；氢键数分析中NZ7以单个氢键为主并在最后60 ns可形成至多3个氢键，venetoclax主要形成2个氢键且氢键数最高。MD结果表明化合物可与BCL-2形成稳定复合物，而venetoclax复合物稳定性更高。

讨论部分总结：分子对接流程经venetoclax再对接验证，活性化合物的关键相互作用残基与既往报道一致；NZ系列活性化合物在对接中显示略高于YZ系列的BCL-2结合潜力，但均低于venetoclax。MD模拟表明化合物可与BCL-2形成稳定复合物，而venetoclax复合物稳定性更高。研究结论翻译：总体而言，本研究结果表明，所选化合物通过调节凋亡信号和升高氧化应激状态，对转移性前列腺腺癌PC3细胞具有显著强效抗癌活性。此外，通过分子建模评估了相对活性化合物与BCL-2结构形成稳定复合物的结合潜力。分子对接研究显示化合物具有与BCL-2结构结合的潜力，但其结合潜力低于共晶venetoclax。根据MD模拟分析，预计化合物形成的复合物是稳定的。同样，venetoclax较所研究化合物具有相对更高的稳定性。尽管本研究未能完全阐明这些分子的综合作用机制，但其强效抗癌作用为其用于治疗方案中的进一步研究提供了重要潜力。