《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Sinensetin Induces Oxidative Stress-Mediated Apoptosis in Non-Small Cell Lung Cancer Cells by Suppressing Nrf2/ARE-Dependent Antioxidant Defense
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非小细胞肺癌（NSCLC）细胞常依赖核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）驱动的抗氧化程序维持氧化还原平衡并逃避凋亡。本研究探讨天然多甲氧基黄酮甜橙素（sinensetin）是否通过干扰该细胞保护通路降低NSCLC细胞存活。将A549和H1
非小细胞肺癌（NSCLC）细胞常依赖核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）驱动的抗氧化程序维持氧化还原平衡并逃避凋亡。本研究探讨天然多甲氧基黄酮甜橙素（sinensetin）是否通过干扰该细胞保护通路降低NSCLC细胞存活。将A549和H1299 NSCLC细胞及正常BEAS-2B支气管上皮细胞暴露于甜橙素。采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞活力，采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）流式细胞术定量凋亡，并通过蛋白免疫印迹（western blotting）分析通路相关和凋亡相关蛋白。通过核/质分离评估Nrf2分布，采用双荧光素酶报告系统评估ARE依赖转录，并通过短发夹RNA（shRNA）沉默Nrf2。采用2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内活性氧（ROS），采用N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）评估抗氧化救援，在BEAS-2B细胞中检测Nrf2/ARE相关蛋白，并在A549细胞中采用Nrf2过表达作为救援手段。甜橙素抑制NSCLC细胞生长，增加凋亡，降低总Nrf2和核Nrf2，降低ARE报告活性，并下调血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）。甜橙素还增加细胞内ROS，而NAC部分减少ROS积累、恢复细胞活力并减少凋亡。BEAS-2B细胞显示相对温和的Nrf2/ARE通路变化。Nrf2过表达部分恢复HO-1和NQO1，减少凋亡信号，并减弱甜橙素诱导的活力丧失和凋亡。这些结果支持如下模型：甜橙素至少部分通过抑制Nrf2/ARE依赖性抗氧化防御促进NSCLC细胞氧化应激介导的凋亡。
研究背景：肺癌因高发病率和死亡率仍是全球肿瘤学的重要挑战，2022年全球估计约250万新发肺癌病例和超过180万死亡病例。非小细胞肺癌（NSCLC）是主要病理类型，约占肺癌的80%–85%，包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌。尽管手术、化疗、放疗、分子靶向治疗和免疫检查点治疗取得进展，但许多患者诊断时已处晚期，且治疗中常发生复发、转移和耐药，临床结局仍不理想，因此具有抗肿瘤活性且毒性相对较低的自然化合物持续受到关注。核因子E2相关因子2（Nrf2）是调控细胞氧化还原平衡、解毒和应激适应的重要转录因子；正常条件下Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）在胞质结合Nrf2并促进其泛素化和蛋白酶体降解，氧化或亲电刺激下Nrf2脱离Keap1控制、在核内积累并激活抗氧化反应元件（ARE）依赖转录，诱导血红素加氧酶-1（HO-1）和NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）等细胞保护基因。该通路对保护非恶性细胞有益，但癌细胞可借持续Nrf2激活增强抗氧化能力、支持肿瘤生长、抑制凋亡并降低抗癌治疗反应；NSCLC中Nrf2/ARE异常激活与凋亡抵抗和治疗抵抗相关，提示阻断该通路可能削弱肿瘤细胞存活机制。已有研究显示某些黄酮如luteolin可抑制A549细胞Nrf2/ARE信号并增强抗癌药物敏感性，但甜橙素是否调控NSCLC细胞Nrf2/ARE依赖性抗氧化防御和凋亡尚不清楚。甜橙素是存在于柑橘皮和Orthosiphon aristatus中的多甲氧基黄酮，具有抗炎、抗氧化、抗血管生成和抗癌活性，并可通过Wnt/β-catenin、血管内皮生长因子（VEGF）/血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）/蛋白激酶B（AKT）、AKT/β-catenin及丝裂原活化蛋白激酶激酶6（MKK6）等多条通路发挥抗癌作用。甜橙素对Nrf2信号的影响具有生物语境依赖性：在四氯化碳诱导的氧化损伤中可激活Nrf2并增强抗氧化保护，而在已建立的癌细胞中持续Nrf2/ARE活性可能帮助肿瘤细胞耐受氧化应激和抗癌治疗。因此，研究人员检测甜橙素对NSCLC细胞增殖和凋亡的影响及其与Nrf2/ARE介导抗氧化防御的关系。总体上，研究显示甜橙素降低NSCLC细胞活力并增强凋亡，A549细胞反应最强；该作用与Nrf2/ARE介导抗氧化防御抑制、细胞内活性氧（ROS）增加和线粒体凋亡信号激活相关，NAC和Nrf2过表达救援提供了功能支持。其意义在于将Nrf2/ARE依赖性抗氧化防御加入甜橙素抗NSCLC的相关信号过程，但原文同时指出高浓度和体外研究等限制。
关键技术方法：研究人员采用A549、H1299非小细胞肺癌（NSCLC）细胞及正常BEAS-2B支气管上皮细胞，细胞系购自中国科学院细胞库（上海，2024年），经短串联重复（STR）鉴定并确认无支原体污染。关键技术包括MTT法测活力、Annexin V-FITC/PI流式细胞术测凋亡、蛋白免疫印迹（western blotting）检测通路与凋亡蛋白、核/质分离评估Nrf2分布、双荧光素酶报告系统检测ARE依赖转录、Nrf2短发夹RNA（shRNA）敲低及Nrf2过表达救援、DCFH-DA检测细胞内ROS、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）抗氧化救援，并在BEAS-2B中比较Nrf2/ARE相关蛋白。
研究结果：
3.1 甜橙素抑制NSCLC细胞增殖：通过MTT法检测A549、H1299和BEAS-2B细胞在0–100 μg/mL甜橙素处理24、48、72 h后的活力，发现NSCLC细胞活力呈浓度依赖性下降，A549细胞在48 h对50和100 μg/mL反应最明显，活力由未处理组的100±8.9%降至65.1±5.9%和48.4±4.3%，H1299反应较弱，BEAS-2B细胞活力未见明显改变；结论为在所测条件下甜橙素对NSCLC细胞的抑制作用强于正常支气管上皮细胞，A549反应最强，且低浓度活力数据不能解释为Nrf2/ARE信号已被抑制，因为通路检测在50和100 μg/mL进行。
3.2 甜橙素诱导NSCLC细胞凋亡：通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测50和100 μg/mL甜橙素处理48 h后的A549和H1299细胞，发现A549两种浓度均明显增加凋亡群体，H1299在100 μg/mL处理48 h后凋亡显著增加；结论为凋亡参与甜橙素对NSCLC细胞的抗增殖作用。
3.3 甜橙素抑制A549细胞Nrf2/ARE介导的抗氧化防御并激活凋亡信号：通过蛋白免疫印迹检测总、胞质和核Nrf2及NQO1、HO-1、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、剪切型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和Keap1，发现50和100 μg/mL处理48 h降低总Nrf2并增加Keap1，伴Nrf2胞质滞留和核Nrf2减少；ARE报告在24 h显著降低；Bax和cleaved caspase-3升高而Bcl-2降低；结论为A549细胞中甜橙素诱导凋亡伴随Nrf2/ARE介导抗氧化信号抑制。
3.4 NSCLC细胞Nrf2表达及Nrf2敲低验证：通过比较A549与H1299细胞总Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白和Nrf2 mRNA，发现H1299总/核Nrf2蛋白低于A549，结合A549对甜橙素反应更强且Nrf2表达较高，后续机制实验主要聚焦A549；A549转染Nrf2-shRNA后Nrf2 mRNA和总蛋白显著降低；结论为Nrf2敲低有效。
3.5 Nrf2敲低调节A549细胞抗氧化和凋亡信号：通过检测control、NC-shRNA和Nrf2-shRNA细胞的Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1、Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3，发现Nrf2敲低降低总Nrf2、HO-1、NQO1和Bcl-2，增加Keap1、Bax和cleaved caspase-3，其中Keap1升高在三次独立实验中可重复；结论为Nrf2缺失削弱抗氧化防御并使凋亡平衡向细胞死亡偏移。
3.6 Nrf2敲低抑制A549细胞增殖并增强凋亡：通过MTT法和Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测Nrf2-shRNA细胞，发现其活力降低、凋亡细胞比例升高；结论为抑制Nrf2/ARE依赖性抗氧化防御至少部分贡献甜橙素在A549细胞中的抗肿瘤活性。
3.7 NAC部分减弱甜橙素诱导的A549细胞ROS积累和细胞损伤：通过DCFH-DA检测ROS并以5 mM NAC预处理1 h进行救援，发现甜橙素显著增加DCFH-DA荧光和细胞内ROS，NAC单独对基础ROS影响小，NAC预处理显著减少甜橙素诱导的ROS增加，并改善细胞活力、减少Annexin V阳性细胞；结论为ROS积累对甜橙素诱导凋亡具有功能贡献。
3.8 甜橙素在BEAS-2B细胞中产生更有限的Nrf2/ARE通路变化：通过蛋白免疫印迹检测50和100 μg/mL甜橙素处理48 h后的Nrf2、HO-1、NQO1和β-actin，发现Nrf2、HO-1、NQO1轻度下降但未达统计学意义，而A549在相同条件下抑制更明显；结合BEAS-2B细胞活力变化有限，结论为非恶性支气管上皮细胞对甜橙素的Nrf2/ARE通路反应较弱。
3.9 Nrf2过表达部分救援A549细胞甜橙素诱导的凋亡信号：通过Nrf2过表达（Nrf2-OE）救援实验，发现Nrf2过表达增加Nrf2并提高HO-1、NQO1，减弱Bax和cleaved caspase-3诱导并部分恢复Bcl-2，同时部分恢复细胞活力并减少凋亡；结论为Nrf2抑制是甜橙素细胞反应的重要组成，但不太可能是唯一涉及的通路。
讨论部分总结：本研究证明甜橙素抑制NSCLC细胞生长并促进凋亡细胞死亡，A549细胞反应更强并用于多数机制实验。甜橙素降低总Nrf2和核Nrf2、降低ARE依赖报告活性、下调HO-1和NQO1，同时增加Bax和cleaved caspase-3并降低Bcl-2；Nrf2敲低重现许多上述变化。NAC部分减少甜橙素诱导的ROS积累和凋亡，Nrf2过表达部分恢复抗氧化信号和细胞存活，两项互补救援支持Nrf2/ARE依赖性抗氧化防御抑制参与A549细胞氧化应激介导的凋亡。甜橙素此前已被报道通过Wnt/β-catenin、VEGF/VEGFR2/AKT、AKT/β-catenin及MKK6等多条信号通路发挥抗癌作用，本研究将Nrf2/ARE依赖性抗氧化防御加入其抗NSCLC相关信号过程。Nrf2在正常组织中保护氧化损伤，但癌细胞可利用持续Nrf2活性维持氧化还原稳态、支持增殖并抵抗治疗相关应激；甜橙素对Nrf2信号的影响具有语境依赖性，在四氯化碳诱导氧化损伤中可激活Nrf2，而在A549 NSCLC细胞中则抑制Nrf2/ARE驱动抗氧化防御并促进凋亡。差异可能与细胞类型、疾病状态、处理浓度、应激环境和遗传背景有关；原文指出未进行直接基因组谱分析或KEAP1突变分析，因此A549更高敏感性不能仅归因于Nrf2依赖或KEAP1状态。凋亡方面，甜橙素增加Bax和cleaved caspase-3、降低Bcl-2，与线粒体凋亡信号激活一致。Nrf2敲低降低HO-1、NQO1和Bcl-2并增加Bax和cleaved caspase-3，伴活力降低和凋亡增加；Keap1在Nrf2敲低后升高，因Keap1通常不视为Nrf2直接转录靶点，原文将其更适当地解释为间接或代偿反应，可能涉及反馈调节或蛋白周转改变；Nrf2过表达部分逆转甜橙素分子和功能效应，不完全救援提示其他通路也可能参与总体反应，甜橙素抑制Nrf2的上游机制（包括转录、磷酸化或泛素-蛋白酶体降解）仍待阐明。原文承认的局限包括：Nrf2/ARE通路显著抑制主要在较高甜橙素浓度下观察到，药理和转化解释需谨慎；研究完全为体外，需体内研究确定生理相关暴露下能否重现抗肿瘤效应和Nrf2/ARE调控；甜橙素降低Nrf2蛋白的上游分子机制尚未解决。
研究结论（译自原文）：综上，甜橙素降低NSCLC细胞活力并增强凋亡，A549细胞反应最强。该效应与Nrf2/ARE介导的抗氧化防御抑制、细胞内ROS增加和线粒体凋亡信号激活相关。NAC部分减弱ROS积累和凋亡，而Nrf2过表达部分恢复抗氧化信号和细胞存活。这些发现支持Nrf2/ARE抑制和氧化应激在甜橙素体外促凋亡作用中的机制角色。需进一步研究阐明Nrf2的上游调控，并确定这些效应能否在体内药理学相关暴露下实现。
