去泛素化酶USP5通过去泛素化并稳定GPX3抑制肺腺癌铁死亡

《Journal of Cell Communication and Signaling》：Deubiquitinase USP5 suppresses ferroptosis in lung adenocarcinoma by deubiquitinating and stabilizing GPX3

　　

铁死亡（ferroptosis）是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，已成为非小细胞肺癌（NSCLC）一个有前景的治疗靶点。然而，非小细胞肺癌细胞逃避铁死亡的具体机制仍有待进一步阐明。研究人员对已发表的NSCLC数据集进行了整合转录组学分析，以鉴定可能参与铁死亡调控的泛素特异性蛋白酶（USPs）。筛选了多种USP蛋白并评估其预后意义，最终选择USP5在两种肺腺癌（LUAD）细胞系和患者来源的LUAD类器官中进行功能研究。在使用铁死亡诱导剂erastin处理后，评估了存活率和转移能力。通过测定已确立的铁死亡标志物和检查线粒体超微结构来评估铁死亡。使用质谱、免疫沉淀和GST pull-down实验研究了蛋白质相互作用。USP5在LUAD组织中显著上调，并与患者不良预后相关。功能实验表明，USP5抑制经erastin处理的LUAD细胞中的铁死亡，从而促进细胞存活、增殖和侵袭能力。机制上，USP5直接结合并去泛素化关键抗氧化酶GPX3，以增强其稳定性。拯救实验证实GPX3是USP5铁死亡抑制功能的功能性介质。这些发现在患者来源的LUAD类器官中得到了进一步支持。该研究确定USP5通过稳定GPX3而成为LUAD中铁死亡的关键抑制因子，揭示了一条使肿瘤能够抵抗氧化应激的新型USP5–GPX3调控轴。靶向该通路可能代表一种有前景的治疗策略。

肺癌是全球第二常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的首要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%以上，其中肺腺癌（LUAD）是最常见的组织学亚型，但患者预后仍较差，复发、转移和治疗抵抗是长期生存的主要障碍。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，近年来被视为NSCLC潜在的治疗靶点。泛素化是调控蛋白质稳定性、定位和活性的关键翻译后修饰，而泛素特异性蛋白酶（USPs）作为去泛素化酶中最大的亚家族，在肿瘤发生发展中发挥重要作用。然而，USPs在LUAD铁死亡调控中的具体功能和分子机制尚不明确。基于此，研究人员旨在系统鉴定可能参与NSCLC铁死亡调控的USPs，并深入探究其作用机制。

研究人员整合分析了TCGA-LUNG和GSE101929两个NSCLC转录组数据集，筛选出多个在肿瘤中高表达且与预后相关的USPs，最终聚焦于USP5。通过多种细胞功能实验和分子生物学实验，并结合患者来源的LUAD类器官模型，发现USP5通过直接结合并去泛素化GPX3，增强其蛋白稳定性，从而抑制铁死亡并促进LUAD细胞的存活、增殖、迁移和侵袭。该研究揭示了一条全新的USP5–GPX3调控轴，为理解LUAD的氧化应激抵抗机制提供了新视角，也为基于铁死亡的靶向治疗提供了潜在策略。

研究采用的主要技术方法包括：基于公共数据库（TCGA-LUNG和GSE101929）的转录组差异表达、生存分析、Gene Ontology（GO）和KEGG富集分析；分子层面采用质谱（MS）、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、泛素化实验、CHX追踪等方法鉴定和验证蛋白相互作用及去泛素化机制；细胞功能层面使用MTT、克隆形成、细胞周期、Transwell、BODIPY 581/591 C11染色、DCF-DA染色、透射电镜（TEM）等评估细胞恶性表型和铁死亡指标；并使用三位LUAD患者原发肿瘤组织来源的类器官进行验证。

研究结果如下：

3.1 Screening of oncogenic USPs potentially involved in the regulation of ferroptosis in NSCLC
通过比较TCGA-LUNG和GSE101929数据集中肿瘤与正常组织的USP表达谱，发现9个USPs在NSCLC中显著上调，其中USP5、USP14、USP18、USP28和USP39在肿瘤中一致高表达。生存分析显示，USP5在所有研究队列中均与较差的总生存期显著相关，而其他USPs的预后意义不一致。功能富集分析表明，USP5相关差异表达基因显著富集于细胞分裂和DNA复制等通路。此外，USP5表达与GPX4、NRF2、RGS4、SLC7A11等铁死亡相关基因呈正相关，提示USP5可能参与铁死亡调控。

3.2 USP5 inhibits the ferroptosis of LUAD cells exposed to erastin
在A549和HCC827两种LUAD细胞系中，研究人员利用特异性短发夹RNA（shRNA）敲低USP5或构建过表达载体，经铁死亡诱导剂erastin处理后进行功能实验。结果显示，USP5敲低显著降低细胞活力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力，并诱导G0/G1期细胞周期阻滞；而USP5过表达则产生相反效果。生化检测显示，USP5敲低导致MDA、GSSG和Fe²⁺水平升高，GSH水平降低，ROS和脂质过氧化增加，线粒体损伤加重；USP5过表达则减轻这些铁死亡标志物变化。Western blot结果显示，USP5能够上调SLC7A11、GPX4和FTH1等铁死亡抑制因子的表达，进一步证实USP5是LUAD细胞中的铁死亡负调控因子。

3.3 USP5 stabilizes GPX3 by removing its ubiquitination in LUAD cells
为阐明分子机制，研究人员在LUAD细胞中过表达HA标记的USP5，通过免疫沉淀-质谱（IP-MS）筛选相互作用蛋白，鉴定到包括GPX3在内的多个铁死亡相关蛋白。Co-IP和GST pull-down实验验证了USP5与GPX3的直接结合。蛋白酶体抑制实验和CHX追踪实验表明，GPX3通过泛素-蛋白酶体途径降解，而USP5能够降低GPX3的多聚泛素化水平并延长其半衰期，从而稳定GPX3蛋白。

3.4 GPX3 mediates USP5's anti-ferroptotic function in LUAD cells
在USP5敲低的A549细胞中过表达GPX3，可恢复细胞活力、克隆形成、细胞周期进展、迁移和侵袭能力，并降低MDA、GSSG、Fe²⁺水平，升高GSH，减少ROS和脂质过氧化，改善线粒体形态；在USP5过表达的HCC827细胞中敲低GPX3则产生相反效应。这些结果表明，GPX3是USP5发挥抗铁死亡作用的关键功能性介质。

3.5 USP5 deficiency inhibits growth and suppresses ferroptosis in LUAD organoids derived from patient tumors
研究人员从三位LUAD患者原发肿瘤组织中成功建立了类器官模型，并确认其表达LUAD标志物CK7、Napsin A和TTF1以及增殖标志物Ki-67。在类器官中敲低USP5并给予erastin处理后，H&E染色显示组织结构无明显破坏，但免疫荧光检测发现Ki-67、CK7和Napsin A阳性细胞比例显著降低，类器官体积增长明显减缓。生化检测显示，USP5敲低进一步加剧erastin引起的MDA、GSSG和Fe²⁺升高及GSH降低，透射电镜观察到更严重的线粒体损伤。Western blot显示USP5、GPX3、GPX4和FTH1表达降低，而铁死亡标志物COX₂表达增加。这些结果在患者来源类器官中进一步验证了USP5对铁死亡的抑制作用。

在讨论部分，研究人员指出，既往研究已报道USP5在其他肿瘤中通过稳定不同底物促进肿瘤进展，而本研究首次揭示USP5通过稳定GPX3抑制LUAD铁死亡的新机制。GPX3作为重要的抗氧化酶，在铁死亡应激条件下发挥促存活作用。研究人员也承认该研究未进行体内动物模型验证，未明确USP5与GPX3相互作用的特定结构域，也未鉴定GPX3上被USP5移除的泛素连接类型，这些有待未来研究。最后，研究结论为：USP5是LUAD中铁死亡的关键负调控因子，其通过直接结合GPX3并去除其泛素链，防止GPX3的蛋白酶体降解，增强其抗氧化功能；这种相互作用促进铁死亡应激下LUAD细胞的存活、增殖和侵袭。该发现揭示了一条新的USP5–GPX3轴，导致LUAD的铁死亡抵抗和肿瘤进展，靶向该通路可能为增强基于铁死亡的LUAD治疗提供新策略。