《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Cycloastragenol Attenuates Cisplatin-Induced Ovarian Toxicity in Rats: Associations With TERT Expression, Apoptotic Balance, and FOXO3a–mTOR-Related Signaling
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顺铂（CIS）诱导的卵巢毒性以卵泡耗竭、细胞凋亡及细胞内生存信号中断为特征。本研究探讨了环黄芪醇（CAG）（一种与端粒酶相关的生物活性化合物）是否能减轻大鼠中CIS诱导的卵巢损伤。将40只雌性Sprague–Dawley大鼠分配到两个溶媒对照组以及CAG组、C
顺铂（CIS）诱导的卵巢毒性以卵泡耗竭、细胞凋亡及细胞内生存信号中断为特征。本研究探讨了环黄芪醇（CAG）（一种与端粒酶相关的生物活性化合物）是否能减轻大鼠中CIS诱导的卵巢损伤。将40只雌性Sprague–Dawley大鼠分配到两个溶媒对照组以及CAG组、CIS组和CIS+CAG组，持续处理15天。在确认无显著差异后，将溶媒对照组数据合并。通过组织学评估卵巢形态和卵泡计数。免疫组化分析包括增殖细胞核抗原（PCNA）、caspase-3、总FOXO3a、磷酸化FOXO3a（Ser253）、总哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、BAX、BCL-2和端粒酶逆转录酶（TERT）。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）评估血清抗苗勒管激素（AMH）及端粒酶相关指标，并通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）测定相对端粒长度。CIS减少了原始卵泡数量，增加了卵泡闭锁，增强了BAX表达，降低了BCL-2和TERT免疫反应性，并提高了BAX/BCL-2比值。CAG联合处理显著改善了BAX、BCL-2、BAX/BCL-2比值及TERT的变化。CIS+CAG组的核内磷酸化FOXO3a显著低于CIS组，而胞质磷酸化FOXO3a无显著差异。CAG联合处理后，总mTOR和caspase-3数值上有所降低，但在多重比较校正后未保持显著性。PCNA、总FOXO3a及血清AMH表现出部分恢复或无显著恢复。各组间相对端粒长度无差异。CAG部分减轻了CIS诱导的卵巢损伤和凋亡失衡，并与卵巢TERT免疫反应性的恢复及磷酸化FOXO3a定位的调节相关。然而，这些发现并不能确立因果性的端粒酶–FOXO3a–mTOR机制。
论文解读文章
一、研究背景与目的
顺铂是一种广泛使用的铂类化疗药物，其抗肿瘤活性主要通过DNA损伤和诱导凋亡实现。然而，其组织选择性有限，会对卵巢造成显著毒性，包括颗粒细胞损伤、卵泡闭锁、原始卵泡池耗竭、卵巢储备功能下降乃至早发性卵巢功能不全。由于原始卵泡构成了有限的卵巢储备，化疗期间的损失可能导致持续的生殖和内分泌后果。原始卵泡的存活与激活受PI3K/AKT/FOXO3a和mTOR等相互关联的细胞内信号网络调控。此外，凋亡是CIS诱导卵巢损伤的另一主要组成部分，BAX促进线粒体膜通透化和促凋亡信号，而BCL-2则拮抗此过程并支持细胞存活。端粒酶催化亚基端粒酶逆转录酶（TERT）除了维持端粒外，还参与线粒体稳态、氧化应激反应、DNA损伤调控和凋亡等非端粒依赖过程。环黄芪醇（CAG）是从黄芪中提取的三萜类化合物，已有报道显示其可增强端粒酶相关活性和TERT相关反应，并具有细胞保护、抗凋亡、抗氧化、抗炎和抗衰老作用，且与改善年龄相关性卵巢功能障碍有关。然而，CAG对CIS诱导的卵巢毒性的影响，以及卵巢TERT免疫反应性、凋亡平衡和FOXO3a–mTOR相关信号之间的关系尚不完全清楚。因此，本研究旨在探讨CAG是否能减轻CIS诱导的大鼠卵巢损伤，并评估治疗相关的卵巢结构、凋亡平衡、TERT免疫反应性及FOXO3a–mTOR相关蛋白分布的变化。
二、主要技术方法
研究人员将40只雌性Sprague–Dawley大鼠随机分为五组：口服二甲基亚砜（DMSO）溶媒对照组、腹腔注射DMSO溶媒对照组、CAG单独给药组、CIS单独给药组以及CAG与CIS联合给药组。CAG以7 mg/kg/day的剂量口服给药，CIS以2 mg/kg/day的剂量腹腔注射给药，连续处理15天。在确认两个溶媒对照组间无显著差异后，将其合并为一个对照组进行后续统计分析。主要技术方法包括：1）组织学处理和卵泡定量分析，通过苏木精-伊红（H&E）染色观察卵巢形态并对原始卵泡、窦前卵泡和闭锁卵泡进行分类计数；2）免疫组化分析，采用半定量H-score方法评估PCNA阳性细胞密度以及caspase-3、总FOXO3a、磷酸化FOXO3a（Ser253）、总mTOR、BAX、BCL-2和TERT的免疫反应性，并对FOXO3a和磷酸化FOXO3a分别进行核质分离评分；3）血清生化检测，通过ELISA试剂盒测定血清抗苗勒管激素（AMH）浓度和端粒酶相关浓度；4）分子生物学分析，采用定量实时PCR（qPCR）测定卵巢组织中的相对端粒长度。
三、研究结果
3.1 组织病理学发现（H&E染色）
溶媒对照组卵巢结构完好，CAG组形态与对照组相似。CIS处理导致显著的卵巢损伤，原始卵泡数量较对照组和CAG组显著减少，闭锁卵泡显著增加。CIS+CAG组中，退行性改变明显减轻，原始卵泡数量显著高于CIS组，与对照组水平相当，窦前卵泡数量也显著增加。
3.2 增殖标志物分析（PCNA免疫组化）
CIS处理显著降低了PCNA阳性细胞密度，尤其在窦前卵泡中。CIS+CAG组PCNA免疫反应性呈部分恢复趋势，但与CIS组相比无统计学显著差异。
3.3 FOXO3a定位与表达
CIS组核内和胞质总FOXO3a免疫反应性均显著低于对照组和CAG组。CAG联合处理显著增加了胞质总FOXO3a免疫反应性，而核内总FOXO3a虽有数值升高但未达统计学显著。
3.4 磷酸化FOXO3a（Ser253）表达与亚细胞定位
CIS组核内磷酸化FOXO3a免疫反应性最高，显著高于其他所有组。CAG联合处理显著降低了核内磷酸化FOXO3a水平。CAG单独给药则显著增加了胞质磷酸化FOXO3a免疫反应性。
3.5 mTOR表达与亚细胞定位
CIS组总mTOR免疫反应性显著高于对照组和CAG组。CIS+CAG组总mTOR H-score数值低于CIS组，但差异未达统计学显著。形态学观察到CIS组胞质染色增强，核内点状模式减少，而CIS+CAG组再次可见核内点状mTOR阳性结构。
3.6 凋亡活性（Caspase-3免疫组化）
CIS组caspase-3免疫反应性显著高于对照组和CAG组。CIS+CAG组caspase-3 H-score数值低于CIS组，但差异未达统计学显著，仅呈现下降趋势。
3.7 BAX和BCL-2免疫反应性
CIS组BAX免疫反应性显著升高，BCL-2免疫反应性显著降低，导致BAX/BCL-2比值显著升高。CAG联合处理显著改善了BAX、BCL-2及BAX/BCL-2比值，但各项指标均未完全恢复至对照组水平。
3.8 TERT免疫反应性
CAG组卵巢TERT免疫反应性最高。CIS组TERT显著降低。CAG联合处理显著增加了TERT免疫反应性，使其恢复到与对照组相当的水平。
3.9 血清AMH水平
CIS组血清AMH水平显著低于对照组和CAG组。CIS+CAG组AMH水平数值高于CIS组，但差异未达统计学显著。
3.10 血清端粒酶相关ELISA测量
CAG组血清端粒酶相关浓度显著高于对照组。CIS组数值降低但不显著。CIS+CAG组显著高于CIS组，接近对照组水平。
3.11 端粒长度分析
各组间卵巢相对端粒长度无统计学显著差异。
四、讨论总结与结论
本研究表明，CAG可部分减轻CIS诱导的大鼠卵巢损伤。凋亡相关结果为CAG的保护作用提供了最一致的证据，CAG联合处理显著改善了BAX、BCL-2及其比值，表明其改善了卵巢凋亡平衡而非完全抑制CIS诱导的凋亡。CAG联合处理还显著增加了胞质总FOXO3a，并显著降低了CIS引起的核内磷酸化FOXO3a升高，提示其对CIS诱导的FOXO3a失调具有调节作用。值得注意的是，CAG联合处理使卵巢TERT免疫反应性恢复至对照组水平，这与先前关于CAG增强端粒酶相关活性的研究一致。然而，由于相对端粒长度在各组间无变化，且TERT免疫组化不能直接测量酶活性，这些发现支持CAG与卵巢TERT免疫反应性的关联，但不能证明保护作用是端粒酶依赖性的。研究的主要局限性包括缺乏直接的卵巢端粒酶活性和TERT mRNA测量、缺少磷酸化mTOR、AKT和PI3K的分析、未使用药理学或遗传学通路抑制、缺乏互补凋亡分析（如TUNEL染色）及长期生殖结局评估。此外，本研究在健康大鼠中进行，未评估CAG是否改变CIS的抗肿瘤疗效，因此这些发现不能直接转化为接受化疗患者的生育力保存策略。
研究结论：CIS诱导的卵巢毒性表现为卵泡耗竭、结构损伤、促凋亡信号偏移、卵巢TERT免疫反应性降低以及FOXO3a和mTOR表达与亚细胞分布的改变。CAG联合处理显著改善了CIS诱导的BAX、BCL-2及BAX/BCL-2比值变化，降低了核内磷酸化FOXO3a免疫反应性，部分恢复了胞质总FOXO3a，并将卵巢TERT免疫反应性提高至对照组水平。相比之下，PCNA阳性细胞密度、核内总FOXO3a、caspase-3、总mTOR及血清AMH仅表现出部分或无显著恢复。这些发现支持CAG对CIS诱导的卵巢损伤具有调节性和部分保护作用，但并不能确立因果性的端粒酶–FOXO3a–mTOR机制。
