优化CRISPR-Cas9电穿孔核糖核蛋白方案实现心肌及骨骼肌细胞的高效基因敲除

《Methods》：A DNA-free CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein electroporation protocol for efficient knockout generation in cardiac and skeletal muscle cell lines

【字体：大中小】 时间：2026年10月27日 来源：Methods 3.6

编辑推荐：

　　摘要背景在心肌细胞相关细胞模型中进行高效、可重复的基因敲除对于心血管研究至关重要，但由于细胞类型对基因组编辑流程具有特异性敏感性，这仍然具有挑战性。方法我们开发了一种优化的 CRISPR-Cas9 基因组编辑方案，通过电穿孔核糖核蛋白（RNP）复合物来生成心脏和骨骼肌细胞的敲

摘要

背景

在心肌细胞相关细胞模型中进行高效、可重复的基因敲除对于心血管研究至关重要，但由于细胞类型对基因组编辑流程具有特异性敏感性，这仍然具有挑战性。

方法

我们开发了一种优化的 CRISPR-Cas9 基因组编辑方案，通过电穿孔核糖核蛋白（RNP）复合物来生成心脏和骨骼肌细胞的敲除系。我们还提供了关于 gRNA 设计、基因分型和克隆系生成的实用指导。利用人类 AC16 类心肌细胞和啮齿动物肌肉衍生细胞系（C2C12、L6 和 H9C2），我们优化了电穿孔条件，以在保证细胞活性的同时最大化编辑效率。

结果

靶向脂质运输调节因子 SAR1B/Sar1b 的 SpCas9-单引导 RNA（sgRNA）RNP 在所有模型中产生了高频移码插入/缺失突变，并显著降低了目标蛋白的表达。结合编辑效率和细胞存活率的复合敲除评分确定了最佳电穿孔设置：AC16 细胞为 1400 伏，10 毫秒，3 个脉冲；C2C12、L6 和 H9C2 细胞为 1500 伏，10 毫秒，3 个脉冲。