水稻抗病激酶OsMAPKKK24被黄单胞菌效应蛋白XopY靶向失活的分子机制

《Journal of Integrative Plant Biology》：Disruption of OsMAPKKK24 activation by the Xanthomonas oryzae effector XopY leads to compromised disease resistance in rice

　　

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应是高度保守的信号模块，在植物抗病性中发挥关键作用。新近证据表明，MAPK级联是植物病原菌效应蛋白的潜在靶标。由水稻黄单胞菌致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的细菌性叶枯病（BLB）是一种毁灭性的水稻病害。Xoo向寄主水稻分泌多种效应蛋白以抑制免疫激活。XopY在不同Xoo菌株中是保守的效应蛋白；然而，XopY如何操纵抗病性及其在水稻中的寄主靶标在很大程度上仍不清楚。本研究报道，来自Xoo菌株PXO86的XopY与MAPK激酶激酶OsMAPKKK24以及类受体胞质激酶55（OsRLCK55）相互作用。OsRLCK55磷酸化OsMAPKKK24，二者通过正向调控早期免疫应答共同参与水稻BLB抗性。XopY通过增强OsMAPKKK24 N端与C端区域之间的分子内相互作用来抑制其激活。XopY与OsRLCK55及OsMAPKKK24的结合还干扰了二者的互作，并抑制了OsRLCK55介导的OsMAPKKK24反式磷酸化，最终阻碍MAPK激活及随后的抗病性。综上所述，这些发现不仅揭示了OsRLCK55和OsMAPKKK24对BLB抗性的关键作用，还阐明了XopY通过操控OsMAPKKK24激活来削弱水稻抗病性的分子机制。

研究背景与科学问题

植物在长期进化中形成了双层免疫系统，包括由病原体相关分子模式触发的免疫（PTI）和效应蛋白触发的免疫（ETI）。其中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是高度保守的关键信号模块，负责将胞外刺激传递至下游转录因子等免疫组分，在植物抗病中发挥核心作用。在水稻中，几丁质激发子受体激酶1（OsCERK1）介导的免疫信号可通过OsRLCK185–OsMAPKKK24–OsMKK4/5–OsMPK3/6通路传导。然而，病原菌也演化出效应蛋白来靶向MAPK级联成员以操纵植物免疫。由水稻黄单胞菌致病变种（Xoo）引起的细菌性叶枯病（BLB）是水稻毁灭性病害之一。Xoo分泌的非转录激活因子样（非TAL）效应蛋白XopY在不同菌株中高度保守，但其如何操纵水稻抗病性、宿主靶标是什么尚不清楚。已有研究表明XopY的一个等位基因Xoo1488可靶向OsRLCK185并抑制其磷酸化，但XopY是否直接靶向MAPK家族成员来操纵水稻抗病性仍有待阐明。为此，研究人员从Xoo菌株PXO86中克隆XopY，系统研究了其与水稻MAPK级联的互作机制。

主要关键技术方法

研究人员采用了酵母双杂交（Y2H）筛选鉴定XopY的互作蛋白；利用分裂荧光素酶互补（split-LUC）和免疫共沉淀（Co-IP）在烟草叶片和水稻原生质体中验证蛋白互作；通过体外激酶实验结合放射自显影和抗磷酸化抗体检测蛋白磷酸化水平；采用RNA干扰（RNAi）和过表达技术在水稻品种中花11（ZH11）背景下获得转基因植株进行功能验证；通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）鉴定XopY的额外互作候选蛋白。

研究结果

XopY是PXO86在水稻中致病所必需的

研究人员成功克隆并在水稻ZH11背景中过表达了来自Xoo菌株PXO86的XopY基因。与野生型相比，过表达XopY的植株（OE-XopY）接种PXO86后病斑显著更长、细菌数量更多，表明XopY增强了PXO86的毒力。进一步研究发现，OE-XopY植株中flg22诱导的MAPK活化和活性氧（ROS）爆发均明显低于野生型，说明XopY通过抑制早期PTI反应来削弱水稻抗病性。

XopY与OsMAPKKK24互作

通过Y2H筛选发现OsMAPKKK24是XopY的互作候选蛋白。split-LUC和Co-IP实验证实了二者的体内互作，且XopY的N端区域与OsMAPKKK24的互作强于C端区域。

OsMAPKKK24正调控水稻对Xoo的抗病性

由于OsMAPKKK24纯合突变致死，研究人员构建了RNAi敲低植株。与ZH11相比，osmapkkk24-RNAi植株接种PXO86后病斑更长、细菌量更多，且flg22诱导的MAPK活化和ROS爆发均降低。相反，过表达OsMAPKKK24的植株则表现出更短的病斑、更少的细菌量，以及增强的MAPK活化和ROS爆发，证明OsMAPKKK24通过调控PTI反应正向调节水稻抗病性。

XopY抑制OsMAPKKK24的激活

体外激酶实验显示，XopY的存在显著降低了OsMAPKKK24的自磷酸化水平。研究人员发现OsMAPKKK24的N端（含激酶结构域）与C端之间存在分子内互作，且C端能够抑制N端的自磷酸化。Co-IP实验表明，XopY在烟草和水稻原生质体中均能显著增强OsMAPKKK24 N端与C端的分子内互作，从而抑制其激活。

XopY抑制OsRLCK55介导的OsMAPKKK24磷酸化

通过IP-MS筛选，研究人员鉴定到XopY的另一互作蛋白OsRLCK55。Y2H、split-LUC和Co-IP证实了XopY与OsRLCK55的互作，且同样依赖XopY的N端区域。Osrlck55敲除突变体接种PXO86后病斑更长，flg22和几丁质诱导的MAPK活化及ROS爆发均降低，且对稻瘟病菌更敏感，表明OsRLCK55对水稻抗病性至关重要。进一步实验发现OsRLCK55与OsMAPKKK24互作，并能磷酸化OsMAPKKK24的C端。体外激酶实验表明，XopY的存在显著抑制了OsRLCK55对OsMAPKKK24的磷酸化。Split-LUC定量分析显示，XopY的共表达显著削弱了OsRLCK55与OsMAPKKK24之间的互作，说明XopY通过竞争性抑制两者互作来阻断免疫信号传导。

讨论与结论总结

MAPK级联作为植物免疫的关键信号模块，常协调防御基因表达及其他免疫反应的变化。本研究表明，Xoo将效应蛋白XopY递送入水稻细胞，靶向OsMAPKKK24并增强其分子内互作，从而降低OsMAPKKK24的激活。同时，XopY与OsRLCK55互作并与OsRLCK55竞争结合OsMAPKKK24，导致OsRLCK55介导的OsMAPKKK24磷酸化减少，免疫信号传导受损，最终削弱水稻抗病性。

讨论部分指出，先前研究中XopY的等位基因Xoo1488靶向OsRLCK185并抑制其被上游OsCERK1磷酸化，但Xoo并不直接触发几丁质诱导的防御。本研究从PXO86菌株克隆XopY，发现其同样抑制flg22诱导的早期PTI反应，并且除了靶向OsRLCK185和OsRLCK55外，还能直接与OsMAPKKK24互作并抑制其磷酸化。研究还发现OsRLCK55可以磷酸化XopY，推测XopY可能在一定程度上模拟OsMAPKKK24的结构，从而竞争性地减少OsRLCK55与OsMAPKKK24的互作及磷酸化，类似于真菌效应蛋白VdHCE1作为底物诱饵抑制宿主MAPK信号的机制。

研究结论总结如下：OsMAPKKK24对水稻抵御Xoo至关重要，其激活受自磷酸化和上游OsRLCK55介导的反式磷酸化的正向调控。然而，由于其重要功能，OsMAPKKK24被效应蛋白XopY靶向——XopY同时抑制OsMAPKKK24的自磷酸化和反式磷酸化，从而阻断免疫信号传导及后续防御反应。这些发现揭示了MAPK级联在水稻抗Xoo中的重要性以及水稻与Xoo互作的复杂性。