HA mRNA-LNP接种新生非洲绿猴感染后HA头部与茎部特异性B细胞应答的差异性调控

《Mucosal Immunology》：Distinct regulation of influenza HA head- versus stem-specific B cell responses in HA mRNA-LNP vaccinated and na?ve infant African green monkeys

　　

流感病毒疫苗接种后记忆B细胞的产生及其在感染后快速招募至病毒特异性免疫应答，是疫苗诱导保护的重要组成部分。研究人员此前报道，表达流感血凝素（HA，hemagglutinin）的mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP，mRNA-lipid nanoparticle）疫苗接种新生非洲绿猴（AGM，African green monkey）后可诱导HA头部和茎部特异性抗体，这些抗体表现出广泛效应功能。疫苗诱导的应答最终使新生AGM较未接种新生AGM获得增强保护。鉴于该年龄组缺乏获批流感疫苗，这些结果值得关注。本研究中，研究人员评估了接种疫苗与未接种动物呼吸道感染后的早期抗体和细胞应答，以深入了解可能与接种新生动物保护改善相关的事件。攻击后7天，研究人员发现接种新生动物肺引流淋巴结中发生类别转换、亲和力成熟的抗体分泌细胞（ASCs，antibody-secreting cells）数量增加，这与记忆B细胞回忆及快速分化为抗体分泌细胞一致。数据与疫苗介导的ASC群体亲和力优势一致。虽然这种优势延伸至HA头部特异性生发中心（GC，germinal center）B细胞，但结合HA茎部的细胞并非如此。这是由于未接种动物中这些细胞表观亲和力意外更高所致。这些数据拓展了研究人员对疫苗接种和感染如何塑造婴儿流感病毒感染后头部与茎部特异性应答激活和分化的理解。

研究背景与问题：流感病毒感染每年造成超过600,000例死亡，6月龄以下婴儿尤其易感，占1岁以下流感住院患者的70%以上。新生儿免疫系统早期偏向耐受，以利于微生物组建立和外来抗原接触，但也导致对感染更易感、对疫苗应答较弱；该年龄组尚无获批流感疫苗。研究人员此前在新生AGM模型中证明，A/California/07/2009（Ca09）HA mRNA-LNP疫苗可诱导HA头部和茎部特异性多功能抗体并提高攻击后保护，但感染后早期回忆性抗体和细胞应答、尤其是HA头部与茎部应答差异尚不清楚。为此，研究人员比较新生期接种HA mRNA-LNP与未接种AGM在Ca09 H1N1攻击后第7天（d7pc）的早期抗体和细胞应答，以揭示与保护改善相关的事件。研究结论提示，接种可促进亲和力成熟记忆B细胞快速分化为ASC，且HA头部与茎部特异性反应存在差异调控，这对理解婴儿疫苗诱导记忆回忆具有重要意义。

关键技术方法（不超过250字）：样本来自Wake Forest University School of Medicine的Vervet Research Colony。13只3–5日龄、体重≥300 g新生AGM分为对照（PBS或荧光素酶mRNA-LNP，n=5）和Ca09 HA mRNA-LNP组（n=8）；左右三角肌各接种3 μg（总6 μg），d39/40加强，d41/45 pb以1×10⁷ TCID₅₀ Ca09 H1N1攻击，d7pc取肺引流气管支气管淋巴结（TBLN，tracheobronchial lymph node）。采用ELISA检测HA及茎部特异性IgM/IgG与亲和力，血凝抑制（HAI）试验、MDCK细胞微量中和、ADCC、ADCP、ADCD功能试验；流式细胞术检测B细胞/ASC及HA探针结合，肽池刺激检测T细胞IFNγ等。

研究结果：
（1）新生期接种HA mRNA-LNP的AGM在感染后d7具有数量更高且功能增强的HA特异性抗体应答。通过ELISA和功能试验发现，接种组HA特异性IgM显著升高而总HA特异性IgG未显著升高；茎部特异性IgG有升高趋势（p=0.051）且显著高于对照；HA和茎部IgG亲和力高于对照；HAI和中和滴度高于对照；接种组ADCC、ADCP和ADCD活性更高，攻击后ADCC和ADCP较接种前增加，对照仅检出ADCP。
（2）新生接种导致病毒攻击后呼吸道抗体增加和肺部T细胞反应减弱。BAL和气管洗液中HA特异性IgG在接种组显著增加；对照肺内增殖性CD4⁺和CD8⁺T细胞比例更高，调节性T细胞（Treg）呈更高趋势。
（3）感染导致对照TBLN中产生IFNγ的滤泡辅助性T细胞（Tfh，T follicular helper）和非Tfh群体显著增加（相较接种组）。接种组Th比例略高但总数无差异；对照Tfh在Th中比例更高，Th和Tfh中IFNγ⁺比例更高，Th增殖更高，Tfh增殖无显著差异。
（4）新生接种AGM的TBLN中HA特异性ASC代表性增加（相较未接种婴儿）。抗原非依赖流式分析显示CD20⁺B细胞、CD95⁺活化B细胞、GC B细胞及ASC总体比例无显著差异；HA探针显示头部和茎部总B/ASC比例无显著差异；头部特异性CD95⁺和GC B细胞在对照显著更高，茎部呈趋势；浆母细胞和浆细胞相似；接种组头部和茎部细胞明显偏向ASC表型。
（5）接种婴儿HA和茎部特异性反应中IgG高于IgM。分析CD95⁺B细胞、GC B细胞和ASC中IgM/IgG分布，接种组各群体明显偏向IgG，对照IgM⁺更高；从GC B细胞到ASC，IgM相对降低；茎部较头部更偏向IgG。
（6）接种导致d7pc头部而非茎部GC B细胞亲和力更高。以Ca09探针MFI及归一化IgG作为亲和力替代指标，接种组HA特异性各群体探针结合更高，ASC最高；归一化后接种组HA特异性群体探针/IgG比更高；头部特异性GC B细胞和ASC接种组更高（非GC B细胞呈趋势，p=0.057），茎部仅ASC更高，非GC和GC B细胞无显著增加；对照茎部GC B细胞探针/IgG比高于其ASC，且高于对照头部GC B细胞；接种组头部与茎部GC B细胞无显著差异。
（7）接种动物头部GC B细胞亲和力更高与CD27⁺B细胞增加相关。头部特异性GC B细胞中CD27⁺比例接种组显著高于对照；茎部特异性GC B细胞无显著差异。

讨论与结论：讨论部分指出，接种新生AGM在d7pc具有更广、更强的中和与非中和抗体功能，ADCC、ADCD和ADCP相关抗体在感染时已存在；以探针/IgG比评估，接种组头部和茎部ASC均呈高亲和力，头部GC B细胞亦高亲和力，符合疫苗诱导亲和力成熟记忆细胞回忆；但茎部GC B细胞未见接种优势，主要因对照茎部GC B细胞表观亲和力意外较高。原文提出，茎部特异性克隆可能在GC中需较高初始亲和力或快速亲和力成熟以竞争，并与Aartse et al.、Keating et al.等研究相呼应；与Angeletti et al.小鼠结果不同，可能涉及模型、抗原构建及未按IgG归一化等因素。T细胞方面，接种组IFNγ⁺Th/Tfh较低可能与病毒载量低、抗原可用性低有关，且仅检测Ca09 HA特异性T细胞。限制包括ADCP仅用THP-1细胞、仅评估单一时间点、头部与茎部应答动力学可能不同。研究结论部分翻译：总体而言，研究人员的发现表明，与已报道的保护结果一致，接种HA mRNA-LNP的新生AGM在d7pc具有更高的HA头部和茎部特异性抗体滴度；这些抗体通过HAI、微量中和、ADCC、ADCP和ADCD检测显示功能改善。d7pc肺引流TBLN细胞应答分析显示，接种导致早期明显偏向ASC，且主要为IgG。数据提示接种使头部特异性GC B细胞在d7pc亲和力增加，符合亲和力成熟记忆细胞回忆。一个意外发现是，未接种队列中茎部特异性GC B细胞表观亲和力相对较高，且与接种动物相似。这些结果为HA mRNA-LNP疫苗建立的免疫应答在感染后的回忆以及婴儿HA茎部与头部特异性反应差异调控提供了新见解；这些反应如何随时间演变以及成人是否表现类似变化值得进一步研究。