CD28共刺激驱动结核分枝杆菌特异性CD4+ T细胞肺实质归巢并介导保护，CTLA-4限制免疫病理

《Mucosal Immunology》：Control of M. tuberculosis infection requires CD28 to generate lung-homing T cells and CTLA-4 to limit immunopathology

　　

控制M. tuberculosis（Mtb，结核分枝杆菌）感染需要CD28（分化簇28）以产生肺归巢T细胞（lung-homing T cells），并需要CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4）以限制免疫病理（immunopathology）。•CD28对针对Mtb感染的保护性T细胞免疫至关重要。•CD28共刺激促进Mtb特异性T细胞定位于肺实质并介导保护。•CD28共刺激的关键窗口在T细胞初始激活（priming）期间，而非T细胞到达肺后或与感染巨噬细胞相互作用时。•CTLA-4限制Mtb特异性T细胞在肺内积累，但为宿主生存所必需。•效应T细胞和调节性T细胞（Tregs，regulatory T cells）均需要CTLA-4以促进Mtb感染期间生存。

结核病仍是全球感染性疾病死亡的重要原因，开发新的疫苗和治疗策略十分迫切。1型辅助性T细胞（Th1，T helper 1）对控制结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染关键，但并非所有Th1细胞均具有同等保护作用。小鼠结核模型显示，Mtb特异性Th1效应细胞的分化状态决定其能否进入肺实质并抑制Mtb生长：KLRG1（杀伤细胞凝集素样受体G1，killer cell lectin-like receptor G1）^?CX3CR1（C-X3-C趋化因子受体1）^?的肺实质CD4⁺ T细胞可进入肺实质并抑制细菌生长，而KLRG1⁺CX3CR1⁺细胞多滞留于肺血管内，过继转移后不具保护性。肺实质KLRG1^? Mtb特异性T细胞增殖潜力更高，可分化为KLRG1⁺亚群；终末分化的Th1细胞则失去控制Mtb的能力。促进未分化KLRG1^? CD4 T细胞产生的疫苗策略更具保护性。因此，理解决定保护性与非保护性Mtb特异性T细胞产生的信号，对理性设计新型Mtb疫苗具有重要意义。T细胞初始激活依赖T细胞受体（TCR）参与、共刺激和细胞因子；细胞因子被认为是决定Th极化的主要因素。Mtb感染中，IL-12p40和IL-27可促进KLRG1⁺血管内Mtb特异性CD4 T细胞形成；多种共刺激分子如CD30/CD153、B7–1/2、ICOS、OX40和4-1BB均与保护相关。CD28（分化簇28，cluster of differentiation 28）是初始T细胞激活的原型共刺激分子，与抗原提呈细胞上的B7–1（CD80）和B7–2（CD86）结合；除初始激活外，CD28共刺激还通过上调抗凋亡分子、改善代谢适应性和增强IL-2产生促进记忆T细胞分化与存活。CD28表达在CD8 T细胞终末分化和功能耗竭中逐步下调；慢性病毒感染中持续CD28共刺激为维持干细胞样CD8 T细胞应答所必需。持续CD28信号又受抑制性受体如CTLA-4（细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4）上调的反向调节，CTLA-4与B7–1/2竞争结合。既往研究表明B7–1/2双敲除小鼠对Mtb高度易感，提示CD28共刺激可能具有保护作用；治疗性阻断CTLA-4是否导致潜伏结核再激活尚未被充分记录，但CTLA4多态性与Mtb风险增加相关。为此，研究人员在小鼠结核模型中解析CD28/CTLA-4轴对Mtb特异性CD4 T细胞初始激活、分化、肺转运和生存的影响。

研究人员发现，Cd28^?/?小鼠Mtb特异性CD4 T细胞应答扩增相对野生型正常，但迅速死于Mtb感染；缺乏CD28共刺激时，终末分化效应CD4 T细胞积聚于肺血管，过继转移后不能提供保护。CD28共刺激的关键作用发生在T细胞初始激活阶段，以产生可转运至肺的保护性T细胞，而肺内Mtb感染巨噬细胞表达B7–1/2并非限制细胞内细菌生长所必需。肺内依赖CD28共刺激的保护性CD4 T细胞高表达CTLA-4；CTLA-4在效应T细胞和调节性T细胞（Treg，regulatory T cells）上均需表达以维持宿主生存，可能与其限制肺内效应T细胞应答所致病理有关。因此，经典共刺激分子CD28为CD4 T细胞分化为肺归巢Mtb特异性效应T细胞提供关键指导信号，而负调控分子CTLA-4为防止致病性炎症所必需。该研究将B7/CD28/CTLA-4共刺激轴确定为Mtb感染中保护性T细胞分化与免疫病理平衡的关键调节环节，对疫苗和免疫治疗策略具有参考意义。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究使用C57BL/6背景野生型、Cd28^+/?、Cd28^?/?、B7–1/2双敲除（B7dKO，B7–1/2 double knockout）、T细胞受体α链敲除（Tcra^?/?，T cell receptor alpha chain knockout）、UbcCRE/ERT2⁺Ctla4^fl/fl（CTLA4iKO）、Foxp3CRE/ERT2⁺Ctla4^fl/fl及混合骨髓嵌合体小鼠；以Mtb H37Rv气溶胶感染，测定肺菌落形成单位（CFU，colony forming units）和生存。采用MHC-II四聚体（I-Ab:Esat6_4–17、I-Ab:EsxG_46–61）、流式细胞术、ex vivo肽刺激、体内CD45静脉染色区分血管内与肺实质、FACS分选过继转移、抗CTLA-4抗体阻断及H&E/QuPath病理分析。单细胞RNA测序（scRNAseq，single-cell RNA sequencing）再分析Akter et al.数据集GSE200639（未感染n=2、感染后50天n=3、100天n=3）。统计采用t检验、ANOVA和log-rank等。

研究结果如下。KLRG1^? Mtb特异性CD4 T细胞在肺实质高度富集CD28共刺激受体通路成员：研究人员再分析Mtb感染小鼠肺scRNAseq数据，发现Klrg1^?活化CD4 T细胞富集Il7r、Tcf7、Cd28、Icos、Tnfsf8、Tnfrsf8、Cd69、Ctla4、Pdcd1、Tigit等长寿命记忆、组织驻留及TCR激活调控基因，Klrg1⁺细胞富集Tbx21、Ifng、Cx3cr1、Nkg7、Itgb2、Gzma、Slamf7等效应基因；Klrg1^?细胞中Cd28、Icos、Cd27、Tnfrsf4（OX40）、Tnfsf8（CD153）、Tnfrsf18（GITR）及Ctla4、Pdcd1、Tigit、Lag3、Blta表达增加，且Ctla4与Cd28表达正相关最强。流式验证显示，感染后28天肺实质iv^?KLRG1^? Esat6四聚体⁺ CD4 T细胞的CD28、CTLA-4和PD-1表达高于iv⁺KLRG1⁺血管内细胞，提示CD28可能差异调控Mtb特异性T细胞亚群发育。

CD28对Mtb保护和肺实质KLRG1^? CD4 T细胞应答重要：Cd28^?/?小鼠气溶胶感染Mtb后高度易感，较野生型约提前120天死亡，Cd28^+/?生存居中；Cd28^?/?小鼠肺内细菌载量在感染后35天和60天约增加1–1.5 log₁₀。尽管CD28在初始T细胞激活中作用明确，Cd28^?/?小鼠肺内Esat6和EsxG特异性CD4 T细胞频率和数量正常，IFNγ和TNF产生及对 cognate 肽的敏感性也与野生型相当；但Cd28^?/? Mtb特异性CD4 T细胞显著偏向KLRG1⁺血管内表型，肺实质iv^?KLRG1^?细胞减少。在野生型:Cd28^?/?混合骨髓嵌合体中，Cd28^?/? T细胞保持na?ve（CD44^lo），肺内检测不到Mtb特异性Cd28^?/? CD4应答，而野生型T细胞优先激活扩增。结论是CD28在非竞争条件下并非克隆扩增所必需，但对决定Mtb特异性T细胞肺内保护性分化具有重要作用。

B7–1/2对保护性Mtb特异性T细胞分化重要：B7dKO小鼠气溶胶感染Mtb后中位生存较野生型缩短约50%，肺内细菌载量在35天和56天增加1–2 log₁₀；感染后35天Esat6特异性CD4 T细胞生成与野生型相当，但B7dKO小鼠肺实质iv^?KLRG1^?细胞比例降低、KLRG1⁺细胞增加，且其KLRG1⁺增加主要位于肺实质（iv^?），而Cd28^?/?小鼠的KLRG1⁺增加主要富集于血管内（iv⁺）。将野生型na?ve CD4 T细胞转移至Mtb感染7天后的野生型或B7dKO宿主，感染后40天B7dKO宿主中的供体野生型T细胞仍较少形成iv^?KLRG1^?、更偏向iv^?KLRG1⁺，说明该分化效应并非胸腺发育缺陷所致。过继转移实验中，未接受T细胞的Tcra^?/?小鼠约37天死亡，接受野生型肺效应CD4 T细胞者约195天死亡，接受Cd28^?/? T细胞者约32天死亡，Cd28^+/?者约130天死亡；B7dKO来源供体T细胞转入Tcra^?/?后也不保护，中位生存约35天，即使转移后CD28信号可恢复。结论是初始激活期缺乏CD28共刺激会产生不能介导保护的T细胞。

T细胞与感染肺巨噬细胞间CD28:B7–1/2互作对Mtb控制非必需：感染后肺泡巨噬细胞和肺实质Ly6C^+/?髓系细胞较其他肺髓系细胞高表达CD80、CD86及PD-L1、PD-L2；肺泡巨噬细胞和单核细胞来源巨噬细胞/树突状细胞均可被Mtb感染。研究人员构建野生型:B7dKO混合骨髓嵌合体，感染后28天分选肺实质髓系细胞（CD3^?/Ly6G^?/B220^?/CD11b⁺/I-Ab⁺/iv^?），等数铺板测定CFU，发现野生型与B7dKO来源髓系细胞内细菌绝对数无差异；混合骨髓嵌合体与仅接受野生型骨髓者相比无生存缺陷，而仅接受B7dKO骨髓者早期死亡，与完整B7dKO小鼠一致。结论是CD28共刺激为产生可转运至肺并控制Mtb的T细胞所必需，但CD28:B7–1/2与感染髓系细胞的互作并非清除Mtb所必需。

CTLA-4抑制肺实质Mtb特异性CD4 T细胞积累但也为宿主生存所需：抗CTLA-4阻断抗体在感染后7–19天或28–40天处理，未观察到生存或肺CFU差异，但抗体治疗受抗药Ig应答限制。利用UbcCRE/ERT2⁺Ctla4^fl/fl诱导性敲除（CTLA4iKO）小鼠，自感染后7天给予tamoxifen，感染后35天Esat6特异性CD4 T细胞频率无差异，但CTLA4iKO小鼠中更多Esat6特异性CD4 T细胞呈肺实质iv^?KLRG1^?表型、较少呈终末分化iv⁺KLRG1⁺表型；然而CTLA4iKO小鼠细菌载量增加、生存较野生型和CRE^?同窝对照下降，H&E显示受累肺面积有增加趋势。感染后30天去除CTLA-4与第7天去除相似，均出现相对野生型的生存缺陷；未感染CTLA4iKO小鼠长期生存亦下降，构成生存数据的重要注意事项。野生型:CTLA4iKO混合骨髓嵌合体中，CTLA-4缺陷T细胞更易呈肺实质iv^?KLRG1^?、较少呈iv^?KLRG1⁺和iv⁺KLRG1⁺，且功能或抗原敏感性无差异。结论是CTLA-4不限制T细胞扩增，而调控其向肺实质效应T细胞分化，同时CTLA-4对限制有害炎症至关重要。

效应T细胞和Treg表达CTLA-4均为Mtb感染后生存所需：CTLA4iKO小鼠及混合骨髓嵌合体CTLA4iKO部分肺内Foxp3⁺ Treg频率显著增加，整体CD4 T细胞和Foxp3⁺ Treg绝对数亦增加。为检验生存差异是否与Foxp3⁺ Treg相关，研究人员用Foxp3CRE/ERT2⁺Ctla4^fl/fl小鼠在感染后7天tamoxifen处理，仅在Foxp3⁺细胞缺失CTLA-4，导致感染后生存较CRE^?同窝对照显著下降。为区分Teff与Treg，研究人员在感染后28天从野生型和CTLA4iKO小鼠肺内分选肺实质Teff（CD4⁺/CD25^lo/CD44⁺/iv^?/CX3CR1^?）和Treg（CD4⁺/iv^?/CD25^hi/Foxp3(GFP⁺)），按不同组合过继至Tcra^?/?小鼠；与全部野生型T细胞相比，接受CTLA-4缺陷Teff者生存下降最显著，且不依赖供体Treg基因型；接受CTLA-4缺陷Treg和野生型Teff者生存有下降趋势但未达统计学显著。结论是效应T细胞和Treg表达CTLA-4对限制Mtb感染期间致病性T细胞应答均重要。

讨论部分总结：CD28共刺激对宿主抵抗Mtb感染关键；B7dKO和Cd28^?/?小鼠生存显著缩短，但肺内Esat6特异性T细胞可积累至与野生型相似频率，混合骨髓嵌合体中仅野生型Mtb特异性T细胞扩增而Cd28^?/? T细胞保持na?ve，说明竞争条件下CD28信号对T细胞激活具有明显优势，而Cd28^?/?宿主易感并非不能产生抗原特异性T细胞应答。B7–1/2缺陷巨噬细胞在混合骨髓嵌合体中载菌量与野生型相似，提示CD28配体表达于巨噬细胞并非细菌控制所必需；但研究不能排除感染野生型巨噬细胞优先耗竭、B7dKO巨噬细胞具生存优势的可能。CD28缺陷深刻影响Mtb特异性T细胞分化，Cd28^?/? Esat6特异性T细胞偏向KLRG1⁺血管内表型；Cd28^?/?来源肺实质T细胞过继后不能提供任何保护，且这些细胞在肽再刺激后IFNγ和TNF产生正常，提示除原型Th1细胞因子外仍存在其他功能缺陷。B7dKO宿主中初始激活的效应T细胞转入表达B7–1/2的Tcra^?/?宿主后仍无保护，强调初始激活期CD28共刺激对Mtb特异性T细胞质量的重要性。CTLA-4诱导缺失增加肺实质KLRG1^? Mtb特异性CD4 T细胞比例，但细菌载量增加、肺炎症增加、生存下降；与PD-1缺陷小鼠增加肺实质KLRG1^? T细胞但因IFNγ致病性过表达而生存下降有相似之处。研究未仅在Mtb特异性T细胞上缺失CTLA-4，但全局CTLA-4缺失未直接影响肽再刺激后IFNγ产生，提示CD28共刺激对极化至肺实质KLRG1^?命运重要，而CTLA-4在肺组织维持表达对减少T细胞介导病理同样重要。Foxp3⁺细胞表达CTLA-4亦对感染后生存关键；该实验未评估细菌载量，尚不清楚生存下降源于细菌控制丧失还是有害炎症。既往显示Mtb特异性T细胞在早期克隆扩增时于淋巴结短暂表达Foxp3，因此Foxp3CRE/ERT2⁺Ctla4^fl/fl小鼠早期死亡是否源于真正Foxp3⁺ Treg还是短暂表达Foxp3的效应T细胞缺乏CTLA-4尚不明确。研究局限包括：完整Cd28^?/?和B7dKO小鼠实验不能排除胸腺选择对Mtb特异性CD4 T细胞表型的影响；细菌载量可影响T细胞质量，CD28缺陷小鼠载量升高且肺实质KLRG1^?细胞减少，但载量不太可能解释CD28缺失时KLRG1^?肺实质T细胞丢失；CD28指导保护性Mtb特异性T细胞分化的下游机制仍不清楚，Cd28^?/? Mtb特异性CD4 T细胞产生IFNγ和TNF与野生型相当，说明保护能力缺陷并非缺乏Th1初始激活，仍需更多数据理解CD28下游对肺实质KLRG1^? T细胞发育、维持和功能必需的通路。研究结论翻译：总体而言，研究人员的发现将B7/CD28/CTLA-4共刺激轴确定为Mtb感染期间保护性Mtb特异性T细胞分化与免疫病理之间平衡的关键调节者。