小鼠出生后脊髓运动神经元非线性放电动力学的发育机制研究

《The Journal of Physiology》：Developmental mechanisms contributing to non-linear firing dynamics in spinal motoneurons of the postnatal mouse

　　

摘要专业翻译 脊髓运动神经元的内在特性支持灵活的运动，包括姿势张力的维持。运动神经元能够产生超出突触输入时程的持续性动作电位输出，这一现象传统上归因于由钠通道和钙通道介导的持续内向电流（persistent inward currents，PICs）。研究人员采用全细胞膜片钳电生理学技术，检测了小鼠出生后发育过程中，特定离子通道如何促进PIC成熟以及快、慢腰髓运动神经元中支持其持续输出的非线性放电动力学。PIC幅度和非线性放电动力学在负重（weight-bearing）出现后于快运动神经元中增加，而慢运动神经元中无此变化。阻断NaV1.6通道在负重前和负重后阶段均降低PIC幅度，而L型钙通道阻断仅在负重出现后降低PIC。然而，单独或联合阻断上述通道以降低PIC幅度，均未能消除持续放电的滞后现象（hysteresis），这可能是因为在该出生后发育阶段PIC尚未完全建立。出乎意料的是，毒蕈碱受体激活增加了PIC幅度，同时却促进了适应性放电动力学，提示PIC本身并不能完全解释持续放电滞后现象。研究人员还发现，对KCNQ和KV1.2通道介导的钾电流进行药理学操作可显著改变放电动力学。值得注意的是，阻断超极化激活环核苷酸门控通道可促进持续放电动力学，并导致快运动神经元出现自持放电。这些结果表明，PIC与非线性放电动力学同步成熟，并将运动神经元非线性放电动力学的现有理论框架扩展至包含其他电压门控离子通道。

论文解读

一、研究背景与科学问题

复杂运动控制的发育是生命早期的重要事件，使动物能够与环境互动、维持姿势并执行协调运动。在啮齿动物中，后肢负重（hindlimb weight-bearing）的出现是运动发育的关键里程碑，通常发生在出生后第二周后半段。这一行为转变反映了脊髓环路和运动神经元内在特性的成熟。持续内向电流（persistent inward currents，PICs）允许运动神经元在被激活后维持放电，被认为有助于支持姿势张力。PIC由钠通道（Na_V1.6）和钙通道（Ca_V1.3）介导，能够放大兴奋性输入并帮助维持膜电位高于动作电位产生阈值，从而支持超出初始突触输入的持续放电。PIC还参与非线性膜电压和放电行为，即输入与输出之间并非严格成比例，小幅度输入变化可产生大幅度放电变化，甚至形成双稳态放电模式。

与PIC相关的常见特征是募集-去募集不对称性（recruitment–derecruitment asymmetry），通常通过三角波电流注入测量，运动神经元在上升支的募集电流高于下降支的停止放电电流，产生特征性的放电-电流关系滞后（hysteresis）。虽然PIC被认为是这些现象的核心机制，但其他内在机制——包括产生放电频率适应（spike-frequency adaptation）和放电阈值容纳（spike-threshold accommodation）的机制——也可能独立于内向电流影响募集、去募集和放电频率。

以往研究强调树突Ca_V1.3电流在强神经调质驱动下介导滞后的作用，但轴突起始段（axon initial segment，AIS）的其他离子通道也可能发挥关键作用。Na_V1.6通道产生持续性钠电流，而K_V1.2和KCNQ等钾通道位于塑造动作电位起始和重复放电的位置。这些AIS钾通道可能不仅仅对抗PIC，还可能主动决定募集和去募集的时序，提供影响放电滞后的补充机制。理解内向与外向电导对运动神经元放电特性成熟的相对贡献，在出生后负重出现阶段尤为重要，因为这些机制的紊乱可能是运动障碍或运动发育延迟的基础。

本研究旨在探究PIC和募集-去募集不对称性在快、慢运动神经元中围绕后肢负重出现前后的成熟过程，并通过选择性药理学操作Na_V1.6、Ca_V1.3、KCNQ、K_V1.2和超极化激活环核苷酸门控（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated，HCN）通道，厘清内向和外向电流对非线性放电行为的相对贡献。研究人员假设PIC幅度和滞后随发育增加，但其他电导在塑造募集-去募集不对称性中发挥决定性作用，为滞后提供更广泛的机制基础。

二、研究设计与主要技术方法

本研究包含未发表数据以及对Sharples & Miles（2021）和Sharples等（2023）已发表实验数据的重新分析。实验涉及117只（雄性55只，雌性62只）野生型C57Bl/6J小鼠（出生后第7–20天，P7–20），另有21只（P7–13；雄性9只，雌性12只）和29只（雄性17只，雌性12只）新实验小鼠。所有程序均依据英国《动物（科学程序）法案1986》执行，实验在圣安德鲁斯大学进行并获动物福利伦理委员会批准。

主要技术方法包括：①全细胞膜片钳电生理记录——在300 μm脊髓横切片上，对腰髓运动神经元进行电流钳和电压钳记录，共获得291个腰髓运动神经元数据；②运动神经元亚型鉴定——基于注入近阈值的5 s方波去极化电流后首个动作电位的潜伏期，区分延迟放电型（快运动神经元）和即时放电型（慢运动神经元）；③药理学操作——使用4,9-anhydro-tetrodotoxin（4,9-AH-TTX）阻断Na_V1.6通道，尼非地平（nifedipine）阻断L型钙通道，毒蕈碱（muscarine）激活毒蕈碱型乙酰胆碱受体，XE991和ICA 069673（ICA73）及瑞替加滨（retigabine）分别阻断和激活KCNQ通道，tityustoxin阻断K_V1.2通道，ZD7288阻断HCN通道；④PIC测量——在电压钳模式下通过慢速去极化电压斜坡（10 mV/s，从?90到?10 mV）测量PIC幅度和起始电压，并从原始电流迹线测量负斜率区（negative-slope region，NSR）深度；⑤募集-去募集滞后测量——在电流钳模式下通过三角波去极化电流斜坡（5 s上升和下降时间）测量募集和去募集电流之差（delta I），并将放电滞后分为四种类型（1型线性、2型适应顺时针、3型线性持续、4型加速持续逆时针）。

三、主要研究结果

（一）PIC和募集-去募集滞后在快运动神经元中随负重阶段同步增加

研究人员在出生后第二周和第三周的小鼠脊髓切片中对腰髓运动神经元进行全细胞膜片钳记录，基于延迟放电和即时放电特征区分快、慢运动神经元亚型。PIC幅度和密度在负重出现后（P10–13）增加，但未在第三周进一步增加。PIC幅度和密度在延迟放电型（快样）运动神经元中大于即时放电型（慢样）运动神经元，这种差异在第二周末出现并持续至第三周。PIC起始电压在延迟放电型中更去极化，但三个发育时间点间无变化。

募集-去募集滞后（delta I）在延迟放电型运动神经元中随发育变得更负（增加），在即时放电型中无变化，且在第二周末达到平台期。放电滞后类型（1–4型）在各运动神经元亚型内部随发育无显著变化，但延迟放电型与即时放电型之间在所有时间点均存在显著差异。

（二）Na_V1.6和L型钙通道对PIC和放电滞后的贡献

阻断Na_V1.6通道（4,9-AH-TTX）在P7–9和P10–13均使漏减PIC幅度降低约34–39%，并使PIC起始电压去极化，两个阶段效应幅度无差异。然而，阻断Na_V1.6通道反而使delta I增加（更负），与“降低PIC幅度应减少滞后”的预测相反。这一增加伴随募集和去募集电流的同步升高，且放电滞后类型比例无变化。4,9-AH-TTX未改变NSR深度。

阻断L型钙通道（nifedipine）在P7–9不改变漏减PIC幅度，但在P10–13使PIC幅度降低约34%。Nifedipine在P10–13显著降低NSR深度，但在P7–9无效应。尽管PIC幅度和NSR深度降低，nifedipine未显著改变delta I、放电滞后类型比例、募集电流或去募集电流。

将运动神经元按基线NSR深度分为小（<100 pA）和大（>100 pA）两组后，nifedipine在大NSR组中显著降低PIC幅度和NSR深度，但两组中delta I均无显著变化。联合阻断Na_V1.6和L型钙通道使漏减PIC幅度降低58%、NSR深度降低88%，但未显著改变delta I或放电滞后。

（三）毒蕈碱对PIC幅度和放电滞后的矛盾调节

激活毒蕈碱受体（muscarine，10 μM）使漏减PIC幅度增加174%，与第二周早期至晚期发育性增加的幅度相当，但不改变PIC起始电压，也未一致改变NSR深度。与预期相反，muscarine使delta I减小（绝对值降低），并将放电滞后类型从3–4型向1–2型转变。这一效应源于去募集电流选择性增加，而募集电流无变化。

（四）钾通道对快运动神经元放电滞后的调节

阻断KCNQ通道（XE991，10 μM）使漏减PIC幅度增加188%，并使PIC起始电压超极化4.9 mV，但降低了NSR深度。在电流钳模式下，XE991使delta I减小，并将放电行为从3–4型向1–3型转变，其机制为募集电流降低而去募集电流不变。

激活KCNQ通道（ICA73或retigabine，10 μM）使delta I增加（更负），募集电流升高，去募集电流无显著变化。阻断K_V1.2通道（tityustoxin，800 nM）使delta I从?305 pA显著减小至?10 pA，募集电流降低，去募集电流无显著变化，放电滞后类型发生显著转变。

（五）HCN通道对放电滞后的调节及自持放电的出现

阻断HCN通道（ZD7288，10 μM）在P14–20阶段使I_h幅度从?89 pA降至13.9 pA，delta I增加（更负），募集和去募集电流均降低。ZD7288还使PIC起始电压超极化，但不改变PIC幅度。值得注意的是，阻断HCN通道后，快运动神经元出现了一种新的第五型放电模式——持续放电超过三角波电流斜坡下降支的终点，需要注入超极化电流才能终止放电，即自持放电（self-sustained firing）的出现。

四、讨论与结论

本研究结果表明，PIC幅度和募集-去募集滞后在快运动神经元中随负重出现而同步成熟，而慢运动神经元中无此变化。L型钙通道功能或表达的增强可能贡献于负重出现后快运动神经元PIC幅度的增加。然而，单独或联合阻断Na_V1.6和L型钙通道虽显著降低PIC幅度和NSR深度，却未减少放电滞后，提示PIC并非放电滞后的唯一决定因素。

毒蕈碱激活增加PIC幅度却促进适应性放电动力学，进一步表明PIC本身不足以解释持续放电滞后。KCNQ通道对抗PIC，并与K_V1.2通道共同塑造募集-去募集不对称性，从而调节快运动神经元的放电滞后。HCN通道产生静息H电流，延迟募集、调节放电滞后，并阻止快运动神经元自持放电的出现。

研究结论：PIC和非线性放电动力学同步成熟，运动神经元非线性放电动力学的机制框架需要扩展至包含除PIC以外的多种电压门控离子通道，包括KCNQ、K_V1.2和HCN通道。这些发现对理解运动发育的细胞机制以及运动障碍的病理生理基础具有重要意义。