羟基丁基壳聚糖寡糖（HBCOS）包覆的血液相容性核壳纳米粒用于热/pH双响应阿霉素控释

《Materials Today Advances》：Hydroxybutyl chitosan oligosaccharide-coated hemocompatible nanoparticles for controlled drug release

　　

目的：血液相容性和控制释放特性是设计药物递送系统以增强癌症治疗疗效的关键因素。本研究旨在以生物相容性热响应羟基丁基壳聚糖寡糖（HBCOS）包覆酪蛋白（casein）核心，设计热/pH双响应核壳纳米粒（CSNPs），并评价其用于阿霉素（DOX）递送的潜力。方法：CSNPs通过以HBCOS包覆酪蛋白核心制备，并对其直径、形貌和核磁共振（NMR）进行表征。通过与大红细胞（erythrocytes）和10%胎牛血清（FBS）孵育评估其血液相容性。载DOX CSNPs在不同pH和温度条件下进行体外释放评价。在37 °C和42 °C下检测HT-29细胞的细胞毒性和胞内DOX释放，并分析核共定位。结果：CSNPs表现出优良的血液相容性，表现为在10% FBS中孵育后无聚集，与红细胞孵育后无溶血。此外，与游离DOX相比，载DOX CSNPs显著延长血液循环并增加DOX吸收。在pH降低和温度升高条件下，DOX从CSNPs中的初始释放速率和累积释放显著增加，表明其具有热/pH双响应释放特性。与37 °C相比，42 °C下与载DOX CSNPs孵育的HT-29细胞活力降低，证实了负载纳米粒的热敏细胞毒性。此外，肿瘤细胞的酸性胞内环境和升高温度促进DOX从CSNPs中的胞内释放及其在细胞核中的共定位，有助于增强抗肿瘤活性。结论：具有优良血液相容性和热/pH响应释放特性的载DOX CSNPs可能作为癌症治疗中有前景的药物递送系统。

论文主体解读

研究背景与问题：响应性纳米粒（NPs）已成为抗肿瘤药物潜在载体，可通过改善药物蓄积、降低毒性和实现控制释放增强疗效。药物释放可由外源性刺激（如光、磁场、温度或超声）或内源性刺激（如pH、氧化还原反应或酶活性）控制，其中pH和温度研究最多。已有pH或温度单响应NPs用于控制释放和增强抗肿瘤活性；为在复杂微环境中更精细调控释放，双响应NPs被设计并验证。肿瘤组织较正常组织具有更低pH和更高温度，因此设计同时响应pH和温度的NPs可通过区分正常与肿瘤组织提高化疗疗效。核壳纳米粒（CSNPs）是单一纳米载体整合多重响应的常用平台。已有pH/温度响应核壳载体，但常用温敏壳为合成聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PNIPAM），生物相容性不足。除响应释放外，NPs表面修饰可减少与血浆蛋白或巨噬细胞相互作用，避免网状内皮系统（RES）清除；载药NPs延长循环可通过增强渗透与滞留效应（EPR）增加肿瘤蓄积，提高疗效。因此，选用生物相容性温敏生物聚合物设计隐形涂层，制备可延长循环的响应性CSNPs是肿瘤治疗的重要目标。羟基丁基壳聚糖寡糖（HBCOS）由壳聚糖寡糖（COS）经1,2-环氧丁烷烷基化制备，前期研究显示其具有优良温敏性。作为COS衍生物，HBCOS可能作为隐形涂层，因为COS可减少吞噬摄取，并通过在纳米粒表面提供亲水层保护循环中的NPs；已有报道COS包覆NPs在50%胎牛血清中蛋白吸附能力低于未包覆NPs，且COS壳NPs较PEG涂层减少巨噬细胞吞噬和摄取。因此，HBCOS壳CSNPs可能延长循环并具优良温度敏感性，增强药物递送效率和肿瘤控制释放。酪蛋白酸钠（SC）在酸性条件下可自组装为胶体核，其酸性基团赋予SC基NPs pH响应性，并可通过离子复合包载碱性药物；SC和HBCOS均被报道可生物降解且生物相容。因此，研究人员设计SC-HBCOS CSNPs为热/pH双敏感且生物相容性优良的载体。

研究开展、结论与意义：研究人员通过顺序组装策略制备稳定CSNPs：带负电SC先在酸性条件下自组装为胶体核，随后带正电HBCOS通过静电吸附于SC核表面，再用京尼平（genipin）共价交联稳定。以DOX为碱性模型药物包载于CSNPs，研究刺激响应性药物释放。研究结论为：HBCOS包覆CSNPs具有优良血液相容性，无吸附聚集或溶血，并在血中延长循环和滞留；CSNPs对DOX的静电包载赋予载DOX CSNPs pH响应性，故载DOX CSNPs表现热/pH双响应释放；低pH和高温（pH 5.5、42 °C）下初始释放更快、累积释放更高；DOX释放机制为Fickian扩散；温度响应性胞内释放、核内共定位和细胞毒性表明肿瘤细胞内部环境和较高温度诱导载DOX CSNPs收缩以增强DOX释放，导致更大细胞毒性。该研究确认这些血液相容性热/pH双响应载DOX CSNPs在癌症治疗中具有前景；未来将在异种移植模型中进行体内抗肿瘤疗效研究以进一步考察其治疗潜力。其意义在于提供了一种以生物相容温敏生物聚合物构建双响应核壳递送系统的策略，但当前结果限于体外细胞模型。

关键技术方法（≤250字）：研究人员以顺序组装制备CSNPs：SC酸性自组装为核，HBCOS静电吸附，京尼平（genipin）共价交联；用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和¹H核磁共振（NMR）表征。以2%红细胞溶血率和10%胎牛血清（FBS）中粒径评价血液相容性；测DOX负载的包封效率（EE）和载药效率（LE）。药代使用8只雌性BALB/c小鼠随机两组，尾静脉注射5 mg/kg DOX等效剂量，0.25–24 h取血；动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，伦理批号HYSD2023-05。释放用透析法在37/42 °C、pH 7.4/5.5测定；HT-29细胞以CCK-8测毒性，流式细胞术（FC）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析摄取与核定位。

研究结果：
3.1 CSNPs的温敏特性：通过TEM、DLS和¹H NMR在37和42 °C比较不同HBCOS浓度制备的CSNPs。较高HBCOS浓度形成核壳结构，升温后壳变薄、粒径减小、粒径分布显著左移；¹H NMR峰向低场移动，提示HBCOS壳与水之间氢键断裂及屏蔽效应诱导壳收缩；低浓度HBCOS时无温敏性。结论为成功制备温敏CSNPs。
3.2 CSNPs的血液相容性与稳定性：通过10% FBS中3天粒径变化、2%新鲜红细胞悬液溶血率及不同浓度稀释后37/42 °C粒径分布评价。CSNPs在血清中粒径不增加，溶血率为负且呈浓度依赖，稀释后粒径和温敏性不变；提示HBCOS包覆CSNPs具有优良血液相容性和稀释稳定性，共价交联克服了HBCOS浓度依赖的温敏特性。
3.3 载DOX CSNPs的表征：通过荧光光谱、EE/LE和温敏粒径评价。DOX装载后荧光强度显著降低，提示DOX与CSNPs间分子相互作用及荧光猝灭；三种CSNPs的EE均>80%、LE均>7%，且不依赖HBCOS浓度，提示DOX装载主要由SC决定，京尼平交联不阻碍DOX扩散入SC核；载DOX后CSNPs仍具温敏性；根据温敏性和结直肠癌血管孔径400–600 nm，选择SC与HBCOS质量比1:0.375的CSNPs进一步实验。
3.4 载DOX CSNPs的药代动力学：通过8只雌性BALB/c小鼠尾静脉注射游离DOX或载DOX CSNPs（5 mg/kg DOX等效剂量）并0.25–24 h取血测定。15 min时载DOX CSNPs组血浆DOX浓度（1.14 μg/mL）显著高于游离DOX组（0.19 μg/mL），全程维持较高水平，0–24 h曲线下面积（AUC）显著更高；提示HBCOS表面包覆显著延长血循环并增加DOX吸收。
3.5 体外响应性释放：通过透析法在37/42 °C、pH 7.4/5.5下测定DOX释放。pH 7.4时8 h内37和42 °C累积释放无显著差异，但42 °C初始释放速率显著更高，归因于HBCOS壳收缩挤出近核表面松散结合的DOX；pH 5.5、37 °C累积释放51.1%显著高于pH 7.4的41.4%，提示pH响应释放；42 °C、pH 5.5时初始释放更快且累积释放达67%；双响应释放由pH依赖的SC核电荷切换和温度诱导的HBCOS壳收缩共同控制。动力学拟合显示一阶模型和Peppas-Sahlin模型最佳（R²>0.99），k₁/k₂>1，Fickian扩散主导；Ritger-Peppas模型n为0.377–0.674，支持Fickian扩散或异常转运。
3.6 体外细胞毒性：通过CCK-8在HT-29细胞中评价。CSNPs在0.125–2 mg/mL孵育24 h后细胞活性>95%，提示CSNPs无细胞毒性；载DOX CSNPs随DOX浓度增加降低细胞活性，呈浓度依赖细胞毒性；同一DOX浓度下42 °C较37 °C显著降低细胞活力，证实载DOX CSNPs的热敏细胞毒性；该差异与pH 5.5下释放曲线相似，提示肿瘤细胞内部环境和温度差可促进DOX释放并增加细胞毒性。
3.7 细胞摄取：通过FC和CLSM评价游离DOX与载DOX CSNPs在HT-29细胞中的摄取和定位。4 h时两者细胞摄取量相似；37升至42 °C时游离DOX摄取显著增加，而载DOX CSNPs摄取不变，提示摄取途径不同：游离DOX为被动扩散，载DOX CSNPs为内吞途径。CLSM显示两者均时间依赖摄取并定位于细胞核；37 °C 4 h时载DOX CSNPs组核内DOX荧光弱于游离DOX，归因于DOX需先从CSNPs释放并逃逸内体后扩散入核；42 °C时两者荧光均增强，载DOX CSNPs因升温诱导收缩促进DOX释放和核内蓄积；温和热疗（42 °C）可通过加速胞内药物释放和核递送增强载DOX CSNPs抗肿瘤效力，但结果限于体外细胞模型。

讨论总结与研究结论翻译：讨论部分总结认为，CSNPs在10% FBS中粒径稳定、无溶血，稀释后温敏性保持，共价交联赋予其优于HBCOS的浓度非依赖温敏稳定性；载DOX后仍具温敏性，药代动力学显示HBCOS包覆延长循环并增加DOX吸收；双响应释放由pH依赖的SC核电荷切换与温度诱导的HBCOS壳收缩共同控制，高温度低pH下释放更快更多，释放以Fickian扩散为主；细胞摄取途径不同于游离DOX，温度促进载DOX CSNPs的胞内释放和核累积，从而增强细胞毒性；当前结果限于体外细胞模型。研究结论翻译：本研究通过HBCOS表面修饰SC核制备温敏CSNPs。HBCOS包覆CSNPs表现出优良血液相容性，表现为无吸附聚集或溶血，并在血中延长循环和滞留。CSNPs对DOX的静电包载赋予载DOX CSNPs pH响应性。因此，载DOX CSNPs表现出热/pH双响应释放特性。在低pH和高温度（pH 5.5、42 °C）下观察到DOX初始释放更快且累积释放更高。DOX从CSNPs中的释放机制为Fickian扩散。温度响应性胞内释放、核内共定位和细胞毒性表明，肿瘤细胞内部环境和较高温度诱导载DOX CSNPs收缩以增强DOX释放，导致更大细胞毒性。该研究确认这些血液相容性热/pH双响应载DOX CSNPs在癌症治疗中具有前景。未来将在异种移植模型中进行体内抗肿瘤疗效研究，以进一步考察载DOX CSNPs的治疗潜力。