《Laboratory Investigation》：Advancing Multiplex Imaging: A Sequential Antigen Retrieval Protocol to Enhance Antibody Compatibility and Detection Sensitivity
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摘要目的抗原检索仍然是多重组织成像中的一大挑战，因为抗体的相互冲突的要求往往限制了某些抗体在面板中的使用。我们测试了各种表位检索方案，以开发一种标准化方法，优化多种标记物的信号检测，这些标记物用于多重成像，如成像质谱细胞术（IMC）。材料与方法对几种类型的组织进行酶法、中间p
摘要
目的
抗原检索仍然是多重组织成像中的一大挑战，因为抗体的相互冲突的要求往往限制了某些抗体在面板中的使用。我们测试了各种表位检索方案，以开发一种标准化方法，优化多种标记物的信号检测，这些标记物用于多重成像，如成像质谱细胞术（IMC）。
材料与方法
对几种类型的组织进行酶法、中间pH和热诱导表位检索（HIER）处理，以确定它们对抗体兼容性和信号检测的影响。
结果
我们的研究结果表明，酶法和中间pH恢复方法对大多数测试抗体无效。相反，一种序贯HIER方法，先使用pH6的柠檬酸盐缓冲液，再使用pH9的EDTA缓冲液，显著增强了对多种抗原的检测。这种两步法方案在免疫组化（IHC）和IMC中均提高了染色强度，在多种组织类型的IMC检测中，23种测试抗体中有19种的信号得到增强。
结论
这些结果建立了一种稳健且可及的策略，以克服抗体兼容性——这仍然是IMC中的主要瓶颈。所提出的序贯抗原检索方案提供了一种实用方法，以扩展抗体面板并改善多重组织分析中的信号检测。
引言
成像质谱细胞术（IMC）是一种先进的成像技术，可实现对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或冷冻组织切片的高度多重分析。通过实现亚细胞分辨率下40多种蛋白标记物的同时检测，IMC为新型生物标志物的识别、致病机制的阐明以及预测性和治疗性靶点的发现提供了强大的方法。这些见解源于对细胞表型、细胞间相互作用以及组织微环境空间组织的深入表征（1）。尽管潜力巨大，IMC仍面临若干方法学和分析挑战。当前空间成像方法的主要局限之一在于从组织图像中准确分割单个细胞，这对于在单细胞水平上量化标记物表达至关重要（2）。因此，更好的信号将有助于实现更高质量的分割。目前已开发了多种计算工具，如HistoCAT（3）、ImaCytE（4）、QuPath（5）以及如Visiopharm等平台，以方便数据分析和可视化。然而，实验方案的标准化，特别是涉及抗体面板设计和抗原检索的方案，仍然是IMC更广泛应用的主要制约因素。由于其方法学与IHC的相似性，IMC的抗体初步选择通常基于其在IHC检测中已证明的效力（6）。与IHC不同，IMC使用直接偶联金属同位素的抗体，无需二次抗体放大和显色检测。这简化了染色方案并减少了实验变异性。尽管如此，抗原检索仍然是影响表位可及性和信号质量的关键步骤（7）。常用的两种主要HIER条件为酸性（pH6，柠檬酸盐缓冲液）和碱性（pH9，EDTA或Tris-HCl缓冲液）。转录因子通常在碱性pH抗原检索条件下检测效果更好，而膜结合蛋白和表面蛋白通常需要酸性pH抗原检索条件（8）。由于IMC是在单个染色循环中进行的，所有抗体都必须与统一的抗原检索条件兼容，通常是pH9的HIER，这对大多数抗体是合适的（9, 10）。这一要求通过排除与这些条件不兼容的抗体，严重限制了面板设计。
为了克服这一局限性，我们开发了一种抗原检索策略，能在不损害信号强度的情况下拓宽抗体兼容性。我们系统评估了包括酶消化、中间pH条件和序贯HIER处理在内的各种抗原检索方法，以确定一种可纳入需要不同检索条件的抗体的方案。我们的结果表明，酶法方法不足以实现可靠的表位暴露。相比之下，先使用pH6柠檬酸盐缓冲液后接pH9 EDTA缓冲液的序贯抗原检索方法，显著增强了更广泛抗体面板的抗原检测，从而能够实现更全面和灵活的多重组织分析。
章节片段
生物材料
本研究使用的所有组织样本均来自布雷斯特大学医院（法国布雷斯特）病理科的注册组织收集库（扁桃体、阑尾、脾脏和结肠）。组织在石蜡包埋前用4%缓冲福尔马林固定。对于后续染色（IHC和IMC），将FFPE样本的4μm组织切片贴附于Superfrost? Plus载玻片上（Thermo Scientific，法国圣埃尔班），并在60°C下干燥2小时后进行处理。本文的
评估免疫组化表位检测的多种检索方法
IHC中最常用的抗原检索技术是在pH6.0柠檬酸盐缓冲液（pH6缓冲液）或EDTA pH9.0缓冲液（pH9缓冲液）中加热至约100°C持续约15分钟。如图所示，在pH9缓冲液的抗原检索条件下，FOXP3可用236A/E7抗体克隆检测到，但在pH6缓冲液条件下检测到较少（图1 A和B）。Ki67在pH6缓冲液和pH9缓冲液两种抗原检索条件下均可用MKi67/2462抗体克隆检测到
讨论
多重成像中的一个关键挑战，特别是对于非循环技术而言，在于能够使用多样化的抗体集检测广泛的蛋白靶标面板。主要局限在于抗原检索步骤，该步骤必须在给定检测中使用的所有抗体之间进行标准化。Shi等人证明，最佳抗原检索条件是热诱导表位检索（11）。商业抗体通常需要特定的抗原
利益冲突声明
作者声明，本研究是在不存在任何可被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
作者感谢Julie Mermier和Louane Hemon分别对IHC方案优化和IMC信号分析的贡献。作者感谢Hyperion流式细胞术核心设施（法国布雷斯特）提供的技术支持，以及欧洲FEDER拨款项目Progos RU 000950和科学兴趣小组（GIS）Biogenouest的成员。
Yuna Delarue|Marion Le Rochais|Nadège Marec|Arnaud Uguen|Soizic Garaud|Divi Cornec|Pierre Pochard|Christophe Jamin|Patrice Hemon
