优化存档前列腺穿刺活检样本的DNA提取方案

《Laboratory Investigation》：Optimizing DNA Extraction From Archival Prostate Biopsy Samples

　　

目的：本研究比较了三种不同的核酸提取方案在一个大型基于人群的前列腺癌队列中的表现，旨在优化从前列腺穿刺针吸活检有限肿瘤样本中获得的DNA产量。 材料与方法：研究人员使用了两种市售提取试剂盒，并确定了能够为测序panel提供足够DNA（定义为总DNA >50 ng）的最小数字化测量肿瘤面积。作为多机构RESPOND研究的一部分，从基于美国的人群癌症登记处招募的643名患者中，处理了代表性的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的前列腺癌活检样本。使用扫描的全切片图像来标注和测量肿瘤区域，随后进行手动宏观切割并使用提取试剂盒分离DNA。 结果：与使用AllPrep试剂盒进行的RNA和DNA联合提取或仅DNA提取相比，QIAamp DNA FFPE Advanced试剂盒产生了最高的中位DNA产量（分别为4.3 vs 2.1或2.1 ng/mm2总肿瘤面积，P = .0004 和 P < .0001）。对于两种试剂盒，DNA产量均与总肿瘤面积显著相关。使用Advanced试剂盒时，采用2 mm2的肿瘤面积截断值，或使用AllPrep DNA/RNA试剂盒时采用5 mm2的截断值，并在十个4-μm组织切片上进行宏观切割，86%至94%的样本可产生>50 ng的总DNA。两种试剂盒在基于panel的测序质量指标（包括重复读段百分比和中位插入片段长度）方面表现相当。在测序时的DNA数量和中位目标覆盖度方面，Advanced试剂盒优于AllPrep试剂盒，但它不允许同时提取RNA。 结论：为了获得至少50 ng的DNA产量，研究人员建议对于前列腺癌穿刺芯针活检样本，若要在十个4-μm宏观切割的组织切片中获得足够的DNA用于提取，其肿瘤面积的截断值为2 mm2。

论文解读

一、研究背景与目的

随着癌症预后判断和治疗决策对遗传学与基因组学分析的依赖日益增加，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织因其广泛可用性而成为分子研究的核心DNA来源。然而，福尔马林诱导的蛋白质-DNA交联及广泛的分子片段化严重损害了从FFPE样本中提取的核酸完整性，给下游分析带来挑战。此前已有研究评估了不同商业化的DNA分离试剂盒在不同组织类型中的表现，发现福尔马林固定和前处理的影响因组织来源而异。此外，不同肿瘤类型有其独特的活检采样技术和不同的肿瘤细胞构成。这种变异性凸显了针对特定组织优化DNA提取方案的迫切需求，以确保分子检测的可重复性和准确性。

本研究旨在通过在一个大规模的前列腺癌活检队列中，系统比较三种不同提取方案（涵盖两种商业化试剂盒）的表现，特别是将DNA产量标准化到宏观切割的肿瘤面积，从而确定最佳策略。鉴于体细胞测序现已成为所有转移性前列腺癌患者的指南推荐检测项目，且通常是在处理条件欠标准化的存档原发肿瘤标本上进行，因此开发稳健且适用于前列腺组织的提取方案至关重要。

二、关键技术与方法

研究人员采用了以下关键技术：

1. 1.
   样本来源：样本来自一项名为RESPOND的多机构研究，该研究通过美国国家癌症研究所的监测、流行病学和最终结果（SEER）项目以及疾病控制与预防中心的国家癌症登记项目，招募了黑人/非裔美国男性前列腺癌患者。样本涵盖了加利福尼亚州、路易斯安那州、佐治亚州、新泽西州、得克萨斯州和密歇根州，代表了美国约40%的新发黑人/非裔美国前列腺癌病例。
2. 2.
   DNA提取方案比较：测试了三种不同的核酸提取方案：方案1为使用Qiagen AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒进行RNA和DNA联合提取；方案2为仅使用该试剂盒的DNA提取模块；方案3为使用Qiagen QIAamp DNA FFPE Advanced试剂盒进行仅DNA提取。
3. 3.
   肿瘤面积量化：病理学家在Concentriq数字病理平台上对苏木精-伊红（H&E）染色的全切片图像进行肿瘤区域标注，计算肿瘤面积。总宏观切割肿瘤面积由单张切片上的肿瘤面积乘以用于宏观切割的白片数量估算得出。
4. 4.
   基于Panel的二代测序（NGS）：将提取的基因组DNA片段化后，使用KAPA HyperPrep试剂盒构建文库，并通过IDT XGen杂交捕获试剂盒进行靶向捕获，最终在Illumina NovaSeq X平台进行测序。使用重复读段百分比、中位插入片段长度和中位目标覆盖度（MTC）作为测序质量指标。

三、主要研究结果

1. 测试QIAamp DNA FFPE Advanced试剂盒

在包含5例根治性前列腺切除术（RP）和5例活检样本的配对初步比较中，Advanced试剂盒在RP样本中未表现出优势，但在活检样本中显示出更高的产量趋势，尤其是在总DNA产量较低的样本中。在后续更大规模的非配对分析中（共141例活检样本），Advanced试剂盒每单位标注总宏观切割肿瘤面积的DNA产量（4.3 ng/mm²）显著高于AllPrep试剂盒的两个方案（均为2.1 ng/mm²，P = .0004 和 P < .0001）。值得注意的是，RNA提取步骤并未显著降低AllPrep方案的DNA产量。

2. 建立协议选择的肿瘤面积截断值

为确保至少80%的样本能产出超过50 ng的总DNA（满足测序panel的最低输入量要求），研究人员设定了截断值。对于AllPrep试剂盒，选择在10张白片上总肿瘤面积为5 mm²（即总宏观切割肿瘤面积50 mm²）作为截断值；对于Advanced试剂盒，则为2 mm²（即总宏观切割肿瘤面积20 mm²）。在此截断值下，86%以上符合条件的样本可获得>50 ng的DNA。

3. 验证队列

研究人员前瞻性地在974例额外活检样本中验证了上述截断值。根据肿瘤面积，482例（49%）样本因总宏观切割肿瘤面积<20 mm²而被判定为不足以进行DNA提取。324例面积在20-50 mm²之间的样本使用Advanced试剂盒提取DNA，168例面积>50 mm²的样本使用AllPrep试剂盒同时提取RNA和DNA。采用此分流策略，两种方案均有接近90%的样本产出>50 ng的总DNA。验证队列再次确认，Advanced试剂盒的单位面积DNA产量（5.98 ng/mm²）显著高于AllPrep试剂盒（2.69 ng/mm²，P < .0001）。

4. 测序性能比较

在测序质量指标方面，两种试剂盒在中位插入片段长度和重复读段百分比上表现相似。但在中位目标覆盖度（MTC）上，Advanced试剂盒表现更优（P < .0001），表明其在有限的样本中能提供更高质量的测序数据。

5. 肿瘤分级和组织块年龄

在进入DNA提取流程的样本中，多数为低/中级别肿瘤，且肿瘤级别分组与单位面积的DNA产量无显著关联（P = .38）。然而，组织块的年龄与单位面积DNA产量呈负相关（P = .003），尤其是超过5年的老块，其DNA产量下降明显。

四、讨论与结论

讨论总结：本研究表明，QIAamp DNA FFPE Advanced试剂盒在小肿瘤样本中能提供更高的DNA产量，这归功于其两步裂解程序和省略初始裂解前的洗涤步骤，最大限度地减少了珍贵样本材料的损失。相比之下，AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒的优势在于能同时纯化DNA和RNA，这对于最大化利用小型活检样本尤其重要。因此，研究人员建议，对于总宏观切割肿瘤面积>50 mm²的样本，优先使用AllPrep试剂盒进行RNA和DNA同步提取；而对于面积在20-50 mm²之间的有限样本，则使用Advanced试剂盒以提高DNA产量。研究优势在于其大型队列和多机构性质，反映了真实世界的样本处理差异。局限性包括未考虑肿瘤细胞密度、宏观切割不可避免地混入良性组织，以及未评估所提RNA的质量。

研究结论翻译：总而言之，本研究结果表明，总宏观切割肿瘤面积至少达到20 mm²的前列腺穿刺活检标本适合进行DNA提取。在有限的样本（总宏观切割肿瘤面积为20-50 mm²）中，或当不需要分离RNA时，优先推荐使用Advanced试剂盒。这些截断值可能有助于分子实验室在处理大量用于测序检测的前列腺活检样本时，最大化样本利用率。