TMEM55B与Protrudin–PDZD8复合体协同维持溶酶体稳态并促进内质网–溶酶体Ca2+信号传导

《Traffic》：TMEM55B Maintains Lysosomal Homeostasis and Promotes ER–Lysosome Calcium Signaling

　　

在内质网（ER）与内体/溶酶体区室之间的膜接触位点（MCSs）处，Protrudin–PDZD8复合体促进内体成熟为溶酶体，该过程伴随酸化。内体成熟与溶酶体酸化及Ca²⁺信号传导均密切相关；然而，将Protrudin–PDZD8复合体与这些过程联系起来的分子机制仍不清楚。在本研究中，研究人员鉴定出溶酶体定位蛋白TMEM55B是Protrudin–PDZD8复合体的结合伴侣。已有报道TMEM55B与液泡型H⁺-ATP酶（v-ATPase）复合体相互作用，提示其在溶酶体功能中发挥作用。抑制TMEM55B表达降低了溶酶体酸化探针的荧光，提示溶酶体酸化受损。此外，TMEM55B耗竭减弱了溶酶体Ca²⁺释放和再摄取，并降低了ATP诱导的ER Ca²⁺反应。这些发现提示ER–溶酶体MCSs处的钙诱导的钙释放（CICR）受损。相比之下，线粒体Ca²⁺动态未受影响。总之，这些结果确定TMEM55B是参与维持溶酶体稳态和调节钙动态的因子。研究人员的发现提示，TMEM55B与Protrudin–PDZD8复合体协同，在ER–溶酶体MCSs处促进溶酶体功能的调节。

该研究围绕内质网（ER）与晚期内体/溶酶体（LE/Ly）之间的膜接触位点（MCSs）展开。ER–LE/Ly MCSs由特定栓系复合体建立，参与脂质转运、内体成熟、溶酶体酸化和Ca²⁺信号传导。胆固醇和Ca²⁺被认为是这些细胞器间通讯的关键介质。PDZD8是一种ER膜蛋白，属于TULIP超家族，含介导脂质转移的突触结合蛋白样线粒体脂质结合蛋白（SMP）结构域；PDZD8与Protrudin、VAP蛋白共同参与ER–LE/Ly MCSs处胆固醇转运。既往研究显示PDZD8缺陷损害脂解并导致脑中胆固醇酯（CE）积累，阿尔茨海默病（AD）患者和AD小鼠模型也存在CE异常积累，携带AD最强遗传风险因子APOE4等位基因的神经元表现溶酶体功能障碍并伴CE积累和脂褐素形成。但PDZD8调控溶酶体功能的机制尚不清楚。同时，溶酶体是重要细胞内Ca²⁺储存库，溶酶体Ca²⁺释放可触发ER上IP₃受体和兰尼碱受体介导的继发性Ca²⁺释放，即钙诱导的钙释放（CICR）；溶酶体酸化还调节双孔通道2（TPC2）和TRPML1等溶酶体Ca²⁺通道活性。TMEM55B是溶酶体膜蛋白，最初被鉴定为将PtdIns(4,5)P₂转化为PtdIns(5)P的磷脂酰肌醇磷酸酶，后显示与v-ATPase和Ragulator复合体结合，参与溶酶体信号和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）激活；TMEM55B敲除小鼠胚胎致死。v-ATPase对内外体酸化至关重要，其通路破坏导致溶酶体功能障碍和贮积症。TMEM55B还涉及动力蛋白依赖的溶酶体逆行运输、氧化应激反应和LDL受体表达调控。然而，TMEM55B是否通过调节溶酶体酸化和Ca²⁺信号参与脂质代谢尚不清楚。因此，研究人员开展本研究，旨在鉴定Protrudin–PDZD8复合体的溶酶体结合伴侣，并解析其对溶酶体稳态和ER–溶酶体Ca²⁺动态的作用。研究结论是TMEM55B与Protrudin–PDZD8复合体结合，参与维持溶酶体功能和Ca²⁺动态；其意义在于揭示TMEM55B与Protrudin–PDZD8复合体协同在ER–溶酶体MCSs处调节溶酶体功能的新机制。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员使用稳定表达3×FLAG-PDZD8的Neuro2A细胞进行抗FLAG免疫沉淀和LC–MS/MS，并以空载体转染细胞排除非特异性结合；在HeLa细胞（ATCC CCL-2）中进行siRNA敲低、小鼠TMEM55B cDNA回补、共免疫沉淀-免疫印迹、共聚焦免疫荧光、split-GFP检测ER–LE/Ly接触、LysoTracker/LysoSensor染色、G-CEPIA1er/Ly-GG/CEPIA3mt活细胞Ca²⁺成像、qRT–PCR和免疫印迹；统计采用Welch t检验、Kruskal–Wallis检验及Steel多重比较等。样本来源为HeLa和Neuro2A细胞；原文说明未涉及人类参与者、人类来源材料或动物。

研究结果如下。2.1 Protrudin–PDZD8复合体与溶酶体蛋白TMEM55B相互作用：研究人员通过Neuro2A细胞稳定表达3×FLAG-PDZD8、抗FLAG免疫沉淀和LC–MS/MS鉴定PDZD8相关蛋白，三次独立实验中鉴定频率（IF）>0.01的蛋白196个，并按GO和UniProt亚细胞定位选出13个内体定位蛋白；Protrudin与PDZD8相互作用最强，TMEM55B及其结合伴侣v-ATPase亚基Atp6v0d1和Lamtor1也在列。免疫共沉淀-免疫印迹确认PDZD8与TMEM55B、Protrudin与TMEM55B相互作用；免疫荧光显示PDZD8和Protrudin主要定位于ER，TMEM55B主要定位于溶酶体；PDZD8与TMEM55B共表达未改变二者定位，而PDZD8与Protrudin或Protrudin与TMEM55B共表达改变定位并形成明显聚集体，提示TMEM55B与Protrudin结合更直接。结论是TMEM55B与Protrudin–PDZD8复合体相互作用。2.2 TMEM55B不是ER–LE/Ly栓系所必需：研究人员用siRNA敲低HeLa细胞TMEM55B，qRT–PCR和免疫印迹确认RNA及蛋白水平显著降低；采用split-GFP系统，以ERj1–GFP(1–10)和LAMP1–GFP(11)及mCherry归一化，检测ER与溶酶体膜近距离并置时重构的GFP荧光；siTMEM55B与siControl的GFP/mCherry比值无显著差异，说明与PDZD8不同，TMEM55B不是ER–LE/Ly MCSs栓系所必需。2.3 TMEM55B维持溶酶体腔稳态：研究人员用LysoTracker和LysoSensor染色HeLa细胞，发现siTMEM55B细胞荧光强度显著降低，提示溶酶体酸化可能受损；但作者指出酸otropic探针荧光不一定仅反映pH，不能据此定论。进一步分析LysoTracker信号显示溶酶体数量/细胞和形态无异常，溶酶体面积减小，但因siTMEM55B细胞LysoTracker荧光弱，不能排除溶酶体仅表现为变小的可能。结论是TMEM55B参与维持溶酶体功能。2.4 TMEM55B促进ER Ca²⁺释放：研究人员在HeLa细胞表达ER腔Ca²⁺指示剂G-CEPIA1er，并与ER标志物KDEL共定位验证；用ATP诱导短暂ER Ca²⁺释放和再摄取。siTMEM55B细胞ATP诱导的ER Ca²⁺反应明显减弱，峰值降低、释放初速率下降、达峰时间延迟、恢复阶段减慢，说明TMEM55B促进ATP刺激的ER短暂Ca²⁺释放。2.5 TMEM55B促进溶酶体Ca²⁺释放：研究人员用溶酶体靶向Ca²⁺指示剂Ly-GG监测溶酶体附近胞质Ca²⁺，并与LAMP1共定位验证；siTMEM55B细胞ATP诱导的溶酶体Ca²⁺反应明显减弱，释放和再摄取速率降低。作为对照，线粒体基质Ca²⁺指示剂CEPIA3mt与Su9–RFP共定位验证后，ATP诱导的线粒体Ca²⁺动态在siControl与siTMEM55B间无显著差异，说明TMEM55B特异性调节溶酶体Ca²⁺动态而不影响线粒体Ca²⁺。2.6 TMEM55B维持溶酶体功能：为排除siRNA脱靶，研究人员用小鼠TMEM55B cDNA回补。LysoTracker分析中，EGFP标记小鼠TMEM55B使TMEM55B耗竭导致的LysoTracker信号降低趋于恢复；Ca²⁺信号分析中，HA标记小鼠TMEM55B表达水平与内源人TMEM55B相当，G-CEPIA1er检测的ER腔Ca²⁺反应和Ly-GG检测的溶酶体附近Ca²⁺反应均恢复至对照水平。结论是TMEM55B维持溶酶体腔状态和ER–溶酶体钙信号，从而在溶酶体功能维持中起重要作用。

讨论部分总结：ER–LE/Ly MCSs介导的内体成熟对溶酶体完整性至关重要，胆固醇和钙跨接触位点运输被认为参与该过程；ER–LE/Ly MCSs破坏与多种神经退行性疾病相关，但内体成熟详细机制尚不完全清楚。Protrudin–PDZD8复合体是促进内体成熟的ER–LE/Ly MCSs核心组分，但其如何促进内体成熟此前不明。本研究鉴定TMEM55B为Protrudin–PDZD8复合体结合伴侣，并显示TMEM55B参与维持溶酶体稳态和调节ER–溶酶体钙动态。作者指出，Protrudin–PDZD8复合体与TMEM55B是否在同一溶酶体调控通路发挥作用尚不清楚，需进一步研究；TMEM55B介导的溶酶体功能调节是否通过v-ATPase亦不清楚；本研究未涉及胆固醇的作用；所用酸otropic溶酶体探针可受膜电位、膜完整性和探针摄取等因素影响，需更精确pH探针验证TMEM55B对溶酶体pH降低的贡献。TMEM55B缺失损害溶酶体Ca²⁺释放和再摄取以及ATP刺激的ER Ca²⁺释放，而线粒体Ca²⁺动态未受影响；本研究中溶酶体Ca²⁺释放约在ATP刺激后180 s内达峰，ER Ca²⁺释放达峰较晚，符合溶酶体Ca²⁺释放触发ER CICR；但ER腔和溶酶体附近Ca²⁺报告反应在分开实验中测量，不能确定两细胞器间Ca²⁺信号的方向性或因果关系，尚待未来研究阐明。研究结论翻译：这些结果确定TMEM55B是参与维持溶酶体稳态和调节钙动态的因子。研究人员的发现提示，TMEM55B与Protrudin–PDZD8复合体协同，在ER–溶酶体MCSs处促进溶酶体功能的调节。讨论末句可译为：TMEM55B可能通过维持溶酶体腔稳态，从而保持溶酶体Ca²⁺通道的正常活性，维持溶酶体Ca²⁺信号，并促进ER–溶酶体MCSs处的CICR。