母胎界面MIXER组织作为早期造血生态位：经典CSF1R+红系-髓系祖细胞与CD4+ eEMPROR细胞的发现

《Nature Immunology》：The maternal–fetal interface is an early hematopoietic niche enriched in distinct erythro-myeloid progenitors

　　

胚胎造血被认为在造血干细胞（HSCs）于主动脉–性腺–中肾区（AGM）出现之前，仅发生于胚胎外卵黄囊。此处，研究人员在小鼠母胎界面鉴定出一个此前未被识别的造血部位，称为MIXER（Maternally Interfaced eXtraEmbRyonic）组织；该组织与卵黄囊同期发育，并表现出强健的造血活性。MIXER富含造血前体细胞，包括经典CSF1R⁺红系-髓系祖细胞（erythro-myeloid progenitors，EMPs）以及独特的胚胎CD4⁺CSF1R^? Erythro-Myeloid PRogenitOR（eEMPROR）细胞群。谱系追踪实验表明，eEMPROR细胞在胎儿发育过程中贡献于选择性巨噬细胞亚群，主要位于血管周围空间。值得注意的是，在HSC出现之前，早期人胎盘绒毛亦含有CD4⁺有核红细胞，提示母胎界面具有保守的造血作用。这些发现确立MIXER为胚胎造血在解剖上独立的生态位，并拓展了哺乳动物血细胞发生的发育图谱。

该研究发表于《Nature Immunology》。胚胎造血长期被认为在HSCs出现前主要局限于胚胎外卵黄囊，随后造血活动按严格时序转移至AGM区、胎盘和胎肝等部位。问题在于，胚胎在HSCs出现前对红细胞供氧及组织重塑中吞噬清除的需求迅速增加，而稳定造血位点尚不存在；既有模型对早期造血来源的认识过度集中于卵黄囊，母胎界面是否含有胚胎来源造血细胞则因解剖取材困难、母胎细胞难以区分及常规分析策略可能排除CD4⁺细胞而被忽视。研究人员据此开展研究，在小鼠中鉴定出MIXER（Maternally Interfaced eXtraEmbRyonic）组织，证明其与卵黄囊同期发育、位于母胎界面、富含造血前体并具多谱系造血活性；除经典CSF1R⁺ EMPs外，MIXER还独特含有eEMPROR（embryonic CD4⁺CSF1R^? Erythro-Myeloid PRogenitOR）细胞。谱系追踪显示eEMPROR细胞在胎儿期主要贡献血管周围巨噬细胞亚群，并持续至出生后；早期人胎盘绒毛在HSC出现前亦见CD4⁺有核红细胞，提示母胎界面造血角色具有保守性。研究结论是MIXER为解剖上独立的胚胎造血生态位，拓展了哺乳动物血细胞发生图谱，并更新了以卵黄囊为中心的早期造血模型；其意义在于提出新的胚胎外祖细胞来源，为理解发育免疫和巨噬细胞个体发生提供新框架。

技术方法：采用定时交配的遗传报告小鼠（β-actin-Cre×mT/mG、DPE-GFP×DPE-GFP:mT/mG、CD4-Cre:Ai14及CD4^CreErt2/wt×Ai14）进行母胎细胞区分与谱系追踪，并以4-OHT（4-hydroxytamoxifen）脉冲标记；结合显微解剖、流式细胞术、共聚焦免疫荧光、OP9基质共培养、MethoCult集落形成及Giemsa染色评估红系-髓系潜能；人早孕胎盘和蜕膜组织来自选择终止妊娠妇女，经维也纳医科大学伦理委员会批准。

研究结果：“MIXER组织的鉴定（Identification of MIXER tissue）”中，通过β-actin-Cre×mT/mG定时交配和全子宫共聚焦成像，发现着床部位母胎界面有胚胎来源mGFP⁺细胞侵入并与母体mTom⁺细胞交织，从而界定MIXER，且未观察到母体mTom⁺细胞进入MIXER。“MIXER组织含胚胎来源造血细胞（MIXER tissue harbors embryo-derived hematopoietic cells）”中，流式和免疫染色在E8.5 MIXER检出胚胎来源红细胞、白细胞、内皮细胞和上皮细胞，Ter119⁺红细胞与CD45⁺白细胞广泛分布，其形态和密度不同于母体细胞。“MIXER组织造血活性检测（Detection of hematopoietic activity within the MIXER tissue）”中，分选mTom⁺ MIXER与卵黄囊细胞行OP9共培养及Giemsa染色，二者均产生红系、髓系和巨核系，提示MIXER具功能性多谱系造血祖细胞。“eEMPROR细胞优先位于MIXER组织（eEMPROR cells preferentially reside within the MIXER tissue）”中，流式显示MIXER与卵黄囊均含CSF1R⁺CD117⁺CD45^loCD93⁺ EMPs，但MIXER的CSF1R⁺细胞更多；GFP⁺mTom⁺CD4⁺ eEMPROR仅见于MIXER，CD4⁺细胞靠近CD31⁺内皮，偶见CD4⁺CD31⁺双阳性。“MIXER组织早在E7.5即显示造血特征（MIXER tissue displays hematopoietic features as early as E7.5）”中，E7.5共聚焦见MIXER内CD31⁺、CD309⁺内皮及CD45⁺、Ter119⁺、CD4⁺胚胎细胞，流式在MIXER选择性检出GFP⁺ eEMPROR和CD115⁺祖细胞，而卵黄囊无eEMPROR。“eEMPROR细胞在后期胚胎发育（eEMPROR cells in later embryonic development）”中，E14.5流式见eEMPROR分布于背主动脉最高频、胎肝和血等，胎头有GFP⁺CD64⁺F4/80⁺巨噬细胞且多位于血管周围；分选eEMPROR可体外生成巨噬、中性粒、巨核和红系集落，E19.5胎肝和发育骨髓仍见eEMPROR。“CD4谱系追踪鉴定胚胎巨噬细胞（CD4-lineage tracing identifies embryonic macrophages）”中，CD4-Cre:Ai14追踪显示E14.5背主动脉和胎肝有lin^?CD115^?CD117⁺tdTom⁺祖细胞，而CD115⁺ cMoP/单核细胞为tdTom^?；tdTom⁺F4/80⁺巨噬细胞见于头、脑膜、胎肝、皮肤和卵黄囊；7周肝少量mGFP⁺巨噬，脑主要限于脑膜PVM，小胶质细胞无mGFP。“CD4⁺祖细胞贡献胎儿和出生后巨噬细胞（CD4⁺ progenitors contribute to fetal and postnatal macrophages）”中，CD4^CreErt2/wt×Ai14在E7.5、E8.5或E9.5脉冲4-OHT，E14.5见tdTom⁺F4/80⁺巨噬，E7.5/E8.5诱导贡献最明显；E8.5脉冲后P14脑膜和肝仍见tdTom⁺CD4谱系巨噬，肝中部分为Clec4F⁺Kupffer细胞。“早期人胎盘组织CD4⁺红系细胞（CD4⁺ erythrocytic cells in early human placental tissue）”中，5周早孕胎盘绒毛免疫染色见CD45⁺白细胞散在，CD4⁺细胞成簇并位于CD31⁺内皮衬覆结构内，不表达CD45/CD14；可见CD4⁺CD235a⁺与CD4^?CD235a⁺有核红细胞，提示HSC出现前存在CD4标记的红系前体样细胞。

讨论部分总结：原文指出MIXER短暂且解剖上不易取材，加之需遗传谱系区分母胎细胞，常规流式在谱系去除时可能排除CD4⁺细胞，故该区域长期处于解剖、技术和分析盲区。原文以E7.5即有造血活动、E8.5 MIXER富含CSF1R⁺ EMPs且选择性富集eEMPROR而卵黄囊缺失、存在CD31⁺/CD309⁺内皮及循环建立前广泛分布的红系/白细胞等证据，论证MIXER并非单纯被动储存卵黄囊来源祖细胞；但原文也指出不能完全排除相邻胚胎外区域间有限的前体细胞移动。MIXER位于母体侧绒毛膜着床界面，与卵黄囊所处卵黄血管轴及微环境不同，原文提出早期EMPs可能在不同生理特化生态位中产生，原始条纹来源中胚层前体可能播种卵黄囊和MIXER，并由局部微环境塑造不同造血程序。eEMPROR细胞与经典CSF1R⁺ EMPs表型不同，具广谱红系-髓系分化及持续贡献胎儿和出生后巨噬细胞的能力，尤其在PVM生态位突出；其功能特化或局部信号塑造机制尚待单细胞转录组、空间和表观遗传研究解析。人研究中，早孕绒毛CD4⁺CD235a⁺有核红细胞位于CD31⁺内皮衬覆结构内，而CD14⁺Hofbauer细胞不表达CD4，提示人母胎界面可能存在尚未阐明的CD4谱系EMP；MIXER与后续胎盘的关系仍未解决，原文提出其可能为短暂的前胎盘界面。研究结论可译为：总之，研究人员的发现拓展了哺乳动物胚胎造血的空间和时间框架；最早的EMP波似乎并非仅起源于以卵黄囊为主导的程序，而是涉及解剖学上不同的胚胎外区域的协同贡献。明确MIXER来源祖细胞如何与卵黄囊及胚胎来源前体细胞整合，以及它们是否执行当前模型未捕捉到的特殊发育功能，对于理解最早血液和免疫谱系如何定位以支持器官发生和长期组织稳态具有重要意义。