锌离子失调转化为过氧化氢在AMPA诱导性神经毒性中的病理学意义

《Journal of Trace Elements in Medicine and Biology》：Pathological significance of converting Zn2?+ dysregulation to H 2O 2 in AMPA-induced neurotoxicity

　　

摘要

黑质-纹状体多巴胺能神经元退行性变是帕金森病（PD）的特征性表现，其致病机制仍有待阐明。尽管过量活性氧（ROS）被广泛认为是PD病理过程的关键介质，但Zn²⁺介导的ROS生成在PD发病机制中的病理意义却知之甚少。由于ROS生成的途径之一是线粒体功能障碍，我们重点关注了线粒体中Zn²⁺介导的ROS生成，并在AMPA诱导细胞外Zn²⁺内流后，检测了源自线粒体ROS的H₂O₂信号通路的病理作用。将AMPA注射至大鼠黑质致密部（SNpc）后，SNpc中出现了线粒体ROS增加和线粒体功能障碍；但在同时注射细胞外Zn²⁺螯合剂CaEDTA后则未出现此现象，提示AMPA诱导的细胞外Zn²⁺内流参与了Zn²⁺失调，进而导致线粒体ROS生成和线粒体功能障碍。此外，AMPA介导的多巴胺能神经元减少不仅被细胞内H₂O₂捕获探针HYDROP所抑制，也被细胞外H₂O₂捕获探针HYDROP-EX所抑制。本研究首次表明，AMPA诱导的Zn²⁺失调通过ROS生成引发SNpc中线粒体功能障碍。源自线粒体ROS的H₂O₂参与了多巴胺能退行性变，而扩散至突触前末梢的H₂O₂可能通过谷氨酸能兴奋作用再次诱导突触后Zn²⁺失调。Zn²⁺失调诱导的持续性H₂O₂信号通路可能促成了SNpc中多巴胺能神经元的选择性损伤。

引言

来源于丘脑底核和杏仁核的谷氨酸能神经元向黑质致密部（SNpc）的多巴胺能神经元提供输入信号[1], [2]。细胞外谷氨酸的异常积累所诱导的兴奋性毒性会非正常激活谷氨酸受体，即离子型受体和代谢型受体亚型，继而在神经退行性疾病中导致突触后神经退变。兴奋性毒性也参与了帕金森病（PD）的发病机制[3], [4], [5], [6]。

在PD病理生理学中，人们关注N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体[7]，并通过NMDA受体调节兴奋性毒性已被认为是保护多巴胺能神经元退变的靶点[8]。与之相比，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体的兴奋性毒性，尤其是Zn²⁺通透性GluR2缺失型AMPA受体的兴奋性毒性，也参与了神经退变[9], [10]，并且兴奋性毒性的调节也被认为是治疗PD患者的靶点[11]。

在大鼠PD发病机制中，多巴胺能毒素如6-羟基多巴胺（6-OHDA）和除草剂百草枯（PQ）通过多巴胺转运体进入多巴胺能神经元并产生活性氧（ROS）。在众多ROS中，H₂O₂具有膜通透性，可逆行扩散至突触前谷氨酸能末梢。H₂O₂激活对H₂O₂敏感的瞬时受体电位样通道TRPM2，随后兴奋谷氨酸能神经元，通过兴奋性毒性诱导的Zn²⁺失调导致突触后多巴胺能神经元退变[12], [13], [14], [15], [16]。细胞外Zn²⁺通过GluR2缺失型AMPA受体（而非NMDA受体）内流，可诱导Zn²⁺失调并减少SNpc中的多巴胺能神经元[17], [18]。相比之下，细胞外Ca²⁺也可通过GluR2缺失型AMPA受体内流，但Ca²⁺内流的毒性低于Zn²⁺内流[19]。由于细胞内（ZnAF-2DA）和细胞外（CaEDTA）Zn²⁺螯合剂均能改善Zn²⁺失调并挽救多巴胺能神经元的减少，Zn²⁺失调是大鼠PD模型中的关键触发因素。

细胞外Zn²⁺的过量内流导致Zn²⁺进入线粒体，继而在皮质培养系统中引发ROS生成和氧化损伤[20], [21]。然而，在SNpc中，Zn²⁺失调向ROS生成的转变在大鼠暴露于AMPA（而非NMDA）后促成了多巴胺能神经元退变[18]。在细胞内ROS中，H₂O₂通过细胞膜上的水通道蛋白扩散至细胞外间隙[22], [23]，并兴奋突触前谷氨酸能神经元[15], [16]。

黑质-纹状体多巴胺能神经元退行性变的致病机制在PD中仍有待阐明，尽管ROS被认为是PD发病机制的关键介质已被广泛接受。多巴胺、神经炎症、铁和基因突变均可诱导ROS生成[24]。然而，Zn²⁺介导的ROS生成在PD发病机制中的病理意义却知之甚少。由于ROS生成的途径之一是线粒体功能障碍[25]，本研究重点关注了线粒体中Zn²⁺介导的ROS生成，并在体内检测了AMPA诱导细胞外Zn²⁺内流入SNpc后源自线粒体ROS的H₂O₂信号通路的病理意义。

章节摘要

实验动物

大鼠（Wistar品系，雄性，10-20周龄，日本SLC，日本滨松）饲养于标准实验条件下（23 ± 1 °C，55 ± 5%湿度），可自由获取水和食物。所有实验均按照静冈大学实验动物护理和使用指南进行。静冈大学伦理委员会已审查并批准了涉及大鼠的实验（伦理批准号：196418，2019年）。

试剂

MitoSOX? Red（Thermo

AMPA诱导Zn²⁺内流引起的线粒体功能障碍

帕金森病的标志性症状，如姿势障碍、静止性震颤和僵直，通常在SNpc中60-80%的多巴胺能神经元丧失后出现[28]。我们使用了此前报道的方案[19]：将AMPA以最低剂量（5 mM，1 μl）单侧注射至SNpc，可在大鼠中诱导阿扑吗啡引起的运动障碍，作为PD症状。AMPA注射至SNpc后，细胞外Zn²⁺通过GluR2缺失型AMPA受体内流，增加了以下水平

讨论

如前所述，本研究中AMPA剂量（5 mM，1 μl）在大鼠中诱导的阿扑吗啡引起的转向行为（运动障碍，作为PD症状）可通过向SNpc共同注射GluR2缺失型AMPA受体的选择性阻断剂NASPM来抑制[17]，也可通过共同注射细胞外（CaEDTA）和细胞内（ZnAF-2DA和TPEN）Zn²⁺螯合剂来抑制[17], [18], [19]。此外，在共同注射

作者贡献

所有作者均可访问本研究中的所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性负责。Atsushi Takeda：概念构思、方法设计、初稿撰写、审阅与编辑；Miki Sasaki、Takato Chinen、Haruna Tamura、Ryusuke Nishio、Haruna Tamano：调查、形式分析、数据整理、验证、可视化

伦理声明

本研究遵循以下动物福利和/或报告指南：所有实验均按照静冈大学实验动物护理和使用指南进行，该指南参考了美国实验动物科学协会（AAALAC）及美国国立卫生研究院（NIH）制定的指南（《实验室动物护理和使用指南》）。本研究已获静冈大学批准。（批准号：伦理批准号

伦理批准

静冈大学伦理委员会已审查并批准了涉及大鼠的动物实验（伦理批准号：196418，2019年）。

资金

无资金资助

CRediT作者贡献声明

Miki Sasaki：方法设计、调查、形式分析、数据整理。Takato Chinen：调查、形式分析、数据整理。Haruna Tamura：调查、形式分析、数据整理。Ryusuke Nishio：验证、监督。Haruna Tamano：验证、监督。Atsushi Takeda：撰写-审阅与编辑、撰写-初稿、验证、项目管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

不适用

Miki Sasaki | Takato Chinen | Haruna Tamura | Ryusuke Nishio | Haruna Tamano | Atsushi Takeda

静冈大学药学院，日本静冈县骏河区矢田52-1，邮编：422-8526，日本