《The Journal of Physiological Sciences》：Mechanical properties of gummies are associated with threat-related behavior and neuroglial markers in mice
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专业术语翻译
咬紧（clenching）是一种持续性的口腔运动行为，与节律性咀嚼（mastication）在本质上有所不同，然而其对脑功能的影响仍不明确，因为现有的口腔功能模型往往同时改变多个感觉运动变量。由于应激状态下的咀嚼已被证实与海马可塑性相关，且齿状回
专业术语翻译
咬紧（clenching）是一种持续性的口腔运动行为，与节律性咀嚼（mastication）在本质上有所不同，然而其对脑功能的影响仍不明确，因为现有的口腔功能模型往往同时改变多个感觉运动变量。由于应激状态下的咀嚼已被证实与海马可塑性相关，且齿状回（dentate gyrus）参与情境性恐惧条件化（contextual fear conditioning），研究人员比较了给予粉状饲料并辅以软质或硬质橡皮糖的小鼠，并以纯粉状饲料和标准颗粒饲料作为参照，评估了基础行为、物体识别、威胁条件化以及齿状回双皮质素（doublecortin, DCX）标记，同时平行检测了皮层胶质标志物。各组间基础行为及物体识别能力无显著差异，而硬质橡皮糖组和颗粒饲料组的情境性僵直（contextual freezing）水平高于软质橡皮糖组。硬质橡皮糖组还表现出更高的齿状回DCX免疫反应性和皮层离子钙结合适配器分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1, Iba-1）水平，而皮层胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）无显著变化。这些发现提示橡皮糖的力学特性与威胁相关行为及神经胶质标志物存在关联，为直接检验口腔运动负荷与神经机制之间的关系提供了研究动机。
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一、研究背景与研究目的
口腔运动功能与脑功能之间的关系是神经科学领域日益受到关注的研究方向。在口腔运动行为中，咬紧是一种与节律性咀嚼截然不同的高负荷口腔运动形式，其特征是在咬合位置附近产生持续的、接近等长收缩的力。研究表明，即使在产生相当的咬合力时，咀嚼与等长咬合/咬紧在颌肌激活模式和颌张开度上仍存在差异。此外，自主性牙齿咬紧已被证实可增强肢体反射兴奋性和运动系统兴奋性，提示咬紧不仅属于摄食行为的组成部分，更是一种与高努力状态和系统性运动促进相关的口腔运动行为。
然而，既往大多数探讨口腔功能与脑功能关系的研究集中于咀嚼功能减退的影响。断乳后软食喂养可降低海马齿状回的成年神经发生，咀嚼功能减退与海马相关的记忆损伤有关；相反，更强的咀嚼负荷与齿状回新生细胞存活率增加相关。应激状态下的咀嚼可减轻应激诱导的齿状回细胞生成抑制、改善海马依赖性空间记忆损伤，并抑制应激诱导的海马长时程抑制和焦虑样行为。
但既有实验模型存在明显局限。软食喂养、拔牙、咬合抬高或应激下咀嚼干预等模型可能同时改变咀嚼活动、口腔感觉输入、咬合支持、食物质地、营养条件、手术损伤、疼痛和应激缓冲效应等多种变量，难以将咬紧这一特定口腔运动变量的独立贡献从整体咀嚼和口腔感觉变化中分离出来。人类观察性研究同样存在类似问题：虽然咬合力与社区老年人的认知功能相关，但此类发现无法将咬紧负荷的特定贡献从更广泛的口腔功能和整体健康状况中分离出来。
基于上述背景，本研究旨在建立一种利用不同力学特性的橡皮糖进行膳食干预的小鼠模型，以探讨口腔运动负荷与脑功能之间的关联。研究选择非情绪性物体识别任务评估基础认知功能，选择威胁条件化任务评估情绪相关行为，并检测齿状回DCX标记及皮层GFAP和Iba-1标记作为神经胶质相关的组织学指标。
二、研究设计与主要结论
研究人员将断乳后第28天（P28）的C57BL/6J雄性小鼠随机分配到四种膳食条件：纯粉状饲料组（Powder）、粉状饲料辅以软质橡皮糖组（Soft）、粉状饲料辅以硬质橡皮糖组（Hard）和标准颗粒饲料组（Pellet）。软质橡皮糖含2.6%明胶，最大压缩载荷为50N；硬质橡皮糖含8.6%明胶，最大压缩载荷为80N。两种橡皮糖均为每颗0.1g，含糖量相同，能量和营养组成尽可能保持一致。小鼠在指定膳食条件下饲养至P63。
研究的主要发现包括：各组体重均随时间增长，但组间百分比增长率无显著两两差异；开放场测试中总运动距离和中心区停留时间在Soft与Hard组间无显著差异；悬尾测试不动时间各组间无显著差异；新物体识别测试中Soft与Hard组的辨别指数无显著组间差异，但Soft组辨别指数显著高于零水平而Hard组未达显著；情境性僵直测试中，Hard组和Pellet组的僵直率显著高于Soft组；LED线索相关回避测试中Soft与Hard组在LED开启隔间总停留时间上无显著差异；组织学检测显示Hard组齿状回DCX荧光强度显著高于Soft组，皮层Iba-1荧光强度和阳性面积均显著高于Soft组，而皮层GFAP免疫反应性无显著组间差异；探索性全视野骨架分析显示Hard组Iba-1阳性结构骨架端点计数显著高于Soft组。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：基于不同明胶浓度制备力学特性不同的软质和硬质橡皮糖，并通过压缩-拉伸流变仪测定最大压缩载荷以量化力学差异；利用MATLAB和DeepLabCut进行行为轨迹提取与定量分析；开放场测试评估自发运动活性和焦虑样行为；悬尾测试评估抑郁样行为；新物体识别测试评估非情绪性物体识别记忆；威胁条件化范式评估情境性恐惧记忆，包括足部电击配对绿色LED线索的条件化训练及情境重暴露僵直率评估；免疫组织化学染色结合共聚焦激光扫描显微镜成像检测齿状回DCX、皮层GFAP和Iba-1的荧光信号；利用Fiji/ImageJ进行图像定量分析，包括荧光强度测量、阳性面积计算及骨架化分析。所有动物实验经日本御茶水女子大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号23007、24017和25007）。
四、研究结果
1. 四种膳食条件下体重均增长
从P28至P56，所有组别体重均随时间增加，Soft与Hard组生长曲线总体相似。体重百分比增长率组间存在显著差异（单因素方差分析，F(3,20)=3.38496，p=0.03832），但Tukey校正后无任何两两比较达到显著水平。
2. 基础行为在各膳食条件下无显著差异
开放场测试中，Soft与Hard组的总运动距离和中心区时间无显著差异。悬尾测试中，各组不动时间无显著差异（单因素方差分析，F(3,19)=1.09469，p=0.37554），表明膳食条件未对基础运动活性和基础情感相关行为产生可检测的影响。
3. 新物体识别表现在Soft与Hard组间无显著差异
Soft与Hard组的辨别指数无显著组间差异（0.32±0.076 vs. 0.17±0.18，p=0.52）。测试阶段Soft组辨别指数显著高于零水平（t(4)=4.17，p=0.01401），而Hard组与零水平无显著差异（t(6)=0.96，p=0.37233）。组间比较不显著不能确立两组识别表现等价，Soft组内显著也不能直接推断Hard组识别受损。
4. 情境性僵直率在不同膳食条件间存在差异
情境重暴露期间的僵直阳性区间百分比在组间差异显著（单因素方差分析，F(3,20)=14.32646，p=3.25454×10??）。Tukey事后检验显示Hard组和Pellet组的僵直率显著高于Soft组（Hard vs. Soft，p=0.04115；Pellet vs. Soft，p=0.04115），Soft与Powder比较未达显著（p=0.06403）。在独立的混合性别队列中，LED开启隔间总停留时间在Soft与Hard组间无显著差异（p=0.14129）。
5. 齿状回DCX标记和皮层Iba-1相关指标在Soft与Hard条件间存在差异
Hard组齿状回DCX荧光强度显著高于Soft组（859.26±69.92 vs. 1106.36±83.25，p=0.046）。皮层GFAP免疫反应性无显著组间差异（p=0.32）。Hard组皮层Iba-1荧光强度（370.77±50.17 vs. 590.95±38.40，p=0.006）和Iba-1阳性面积（8703.33±2419.16 vs. 18071.33±2588.79，p=0.025）均显著高于Soft组。探索性全视野骨架分析显示Hard组骨架端点计数显著高于Soft组（3293.00±157.14 vs. 4124.33±53.46，p=0.002273）。
五、讨论与结论
本研究表明橡皮糖力学特性的差异与威胁相关行为及神经胶质标志物存在关联。在Soft与Hard的主要比较中，基础行为无显著差异，非情绪性物体识别无显著组间差异，但情境性僵直率存在差异，Hard组齿状回DCX免疫反应性和皮层Iba-1水平更高，而皮层GFAP无显著变化。
研究人员指出，咬紧作为一种高负荷口腔运动行为，与节律性咀嚼在颌肌激活模式和颌张开度上存在差异，但本研究观察到的僵直差异是否反映咬紧相关的口腔运动负荷仍有待确定。Powder和Pellet组作为参照条件，Soft-Hard与Powder-Pellet僵直模式的平行方向也与膳食硬度或咀嚼的广泛效应相容。
非情绪性物体识别未显示明确的组间差异，与既往软食喂养或咀嚼减退研究中观察到的记忆损伤并不直接矛盾，因为大多数既往模型实质上改变了咀嚼本身、口腔感觉输入及相关外周条件。
情境性僵直率的差异表明膳食条件与威胁相关情境中的行为表达差异相关联。更高的僵直率可能反映更强的威胁记忆、更大的泛化、更差的辨别或防御行为表达的改变，本实验无法区分这些解释。需要指出的是，本研究任务未直接评估经典情境性恐惧辨别，因此不能得出模式分离改善的结论。
组织学发现提供了Soft与Hard条件间神经胶质标志物差异的进一步证据。Hard组齿状回DCX免疫反应性更高，与既往较强咀嚼负荷增加齿状回新生细胞存活的报告一致，但本研究DCX测量反映荧光强度，不直接量化神经发生或新生细胞存活。皮层Iba-1荧光强度、阳性面积和骨架端点计数在Hard组更高，但这些测量单独不能定义小胶质细胞激活状态。皮层GFAP无显著差异。
关于机制，研究人员提出三叉神经通路和蓝斑-去甲肾上腺素系统可能参与其中，但本研究未直接测量颌肌肌电图、咬合力、蓝斑活动或脑单胺动态，该通路仅作为未来研究的候选机制。
本研究存在以下局限：未直接测量咬合力或颌肌活动；橡皮糖实际消耗量未定量记录；DCX、GFAP和Iba-1分析为相关性研究，不能证明组织学变化因果介导威胁相关行为差异；骨架端点分析为视野水平测量，未量化单个小胶质细胞形态；主要队列使用年轻成年雄性小鼠，LED线索相关回避队列混合性别且未设计检验性别效应；情感相关记忆评估仅限于威胁条件化范式；行为测试以固定顺序在同一批小鼠中进行，无法排除先前测试对后续测量的影响。
综上所述，本研究为考察橡皮糖力学特性差异如何与行为和神经胶质指标相关联提供了实验步骤。在现有条件下，非情绪性物体识别无显著组间差异，而威胁相关行为、齿状回DCX标记和皮层胶质相关标志物存在差异。研究结果提示在考虑口腔功能与脑功能关系时，需要将口腔和咀嚼行为分解为更具体的运动组分进行考察。未来研究需结合颌肌活动和咬合力的直接测量、齿状回可塑性或胶质功能的操控、定量小胶质细胞形态分析以及纳入性别和衰老因素的模型，以进一步检验咬紧相关口腔运动负荷对脑可塑性的潜在贡献。
