羟基苯希夫碱衍生物作为牛乳乳过氧化物酶抑制剂：酶抑制、计算分析及互补生物学评价

《Journal of Molecular Structure》：Hydroxyphenyl Schiff Base Derivatives as Bovine Milk Lactoperoxidase Inhibitors: Enzyme Inhibition, Computational Analysis and Complementary Biological Evaluation

　　

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  采用体外与计算模拟相结合的方法，评估了合成的席夫碱衍生物（S1–S4）作为新型乳过氧化物酶抑制剂的潜力。
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  所有化合物均表现出纳摩尔级的抑制活性（Ki?=?10.78–28.62 nM）。
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  分子对接分析证实了强结合亲和力，其中S4显示出最低的结合能（?7.79 kcal/mol）。
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  ADME分析表明未违反Lipinski五规则，表明具有优良的类药性质。
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  S4表现出最高的抗菌活性（MIC?=?0.03125–0.5 mg/mL）以及在MDA-MB-231细胞系中最强的细胞毒性（IC₅₀?=?4 μM），被确定为有前景的先导化合物。

引言

乳过氧化物酶（LPO）是一种含血红素的糖蛋白酶，在哺乳动物的先天免疫防御中发挥至关重要的作用[1,2]。LPO最初在乳中发现，是牛乳中最丰富的酶之一，约占乳清蛋白的0.5%，浓度约为30 mg/L[3]。除乳汁外，LPO还存在于唾液、泪液和呼吸道液体中，对黏膜免疫有重要贡献[[4]、[5]、[6]、[7]]。结构上，LPO由约695个氨基酸组成，具有共价结合的血红素基团和对催化活性至关重要的钙结合位点[8]。LPO在过氧化氢（H₂O₂）存在下催化卤化物底物的氧化，特别是硫氰酸盐（SCN?）、碘化物（I?）和溴化物（Br?），产生过硫氰酸盐（OSCN?）和次碘酸盐（OI?）等活性抗菌化合物[[9]、[10]、[11]]。这些产物通过与蛋白质的巯基相互作用抑制细菌代谢途径，从而产生抑菌效果[12]。由LPO、H₂O₂和SCN?组成的LPO系统在采奶后至少保持活性一小时。近期研究强调，LPO基因缺陷与炎症增加、肿瘤形成和代谢紊乱相关，表明LPO的重要性超越抗菌活性[[13]、[14]、[15]]。磺胺（SFA）是一种已知的LPO抑制剂，在LPO抑制研究中作为参考化合物[16]。然而，开发比SFA具有更强效力的新型抑制剂仍然是药物化学的重要目标[17]。

鉴于LPO的治疗意义以及席夫碱已建立的生物特性，研究席夫碱衍生物作为LPO抑制剂是一个有前景的研究方向。亚胺类是具有亚胺键（>C=N–）的多功能有机化合物，具有多样的生物活性，包括抗菌、抗癌、抗氧化和抗炎特性[18,19]。亚胺基团对其生物活性至关重要，席夫碱的金属配合物通常比游离配体显示出显著增强的抗菌活性[20,21]。已有研究表明，席夫碱不仅具有广泛的生物活性，近年来也作为多种酶的有效抑制剂候选物引起了关注。对脲酶、碳酸酐酶和胆碱酯酶等酶的研究表明，席夫碱可以表现出强抑制活性，这一效果可通过分子对接、DFT和ADME分析来支持[[22]、[23]、[24]、[25]、[26]]。这些发现表明席夫碱是新酶抑制剂开发中的重要化学骨架。然而，评估席夫碱作为LPO抑制剂的研究相当有限。文献中关于LPO的大多数研究集中在天然产物、酚类化合物、磺胺衍生物和药物分子上，关于席夫碱的研究仅有少数[16,[27]、[28]、[29]]。此外，现有研究主要涉及基于硫代酰肼的席夫碱。然而，携带不同含氮杂芳环（如吡啶、喹啉和1,10-菲啰啉）的羟苯基席夫碱对LPO抑制的影响，以及这些结构变化对抑制机制的贡献，尚未得到系统的阐明。

S1-S4的选取基于比较结构设计，而非任意化合物筛选。这些化合物代表一个密切相关系列，保留了羟苯基席夫碱骨架，同时改变杂芳基的大小、芳香性和氮环境。这种设计允许在定义的结构修饰下考察抑制响应，同时最大程度减少共同分子骨架带来的差异。特别是，从简单的含吡啶结构进展到更扩展的喹啉和1,10-菲啰啉体系，提供了评估杂芳复杂性增加是否与LPO抑制变化相关的机会。因此，S1-S4被选为建立初步LPO构效关系的聚焦结构集合。

席夫碱不仅作为酶抑制剂值得关注，还具有抗菌和抗癌作用。尽管先前研究报告了多类化合物对LPO的抑制作用，但对携带不同含氮杂芳基的羟苯基席夫碱的系统研究仍然有限。本研究的主要目的是采用体外和计算方法，评估合成席夫碱衍生物（图1）对LPO的抑制作用，从而揭示其构效关系。此外，进行了ADME分析以评估化合物的类药潜力，并考察其抗菌和抗癌活性，以更全面地揭示其整体药理学特征。

章节摘要

从牛乳中纯化LPO

具有90.0 EU/mg蛋白比活性的牛LPO以6.92%的产率和529.4的纯化倍数纯化获得（表1）。通过SDS-PAGE检测酶纯化。如图2所示，在约78 kDa处观察到单一条带（线a）。图1中呈现的化合物分别在体外条件下测试，以分析其作为LPO抑制剂的有效性。

体外酶抑制研究

本研究评估了四种席夫碱衍生物对LPO的抑制效力，并对其进行了比较

结论

四种羟苯基席夫碱衍生物（S1-S4）与计算和互补生物学分析相结合，评估了它们对牛LPO的抑制作用。在这些衍生物中，S1表现出最低的IC₅₀值，而S2基于非线性动力学分析显示出最低的K_i值。相比之下，S4表现出最强的抗菌活性以及对MDA-MB-231细胞最高的细胞毒性。LPO抑制效力与…不呈现平行趋势

化学试剂和其他消耗品

所有溶剂和其他试剂均购自Merck和Sigma‐Aldrich。

仪器设备

低温离心机（Hermle Z 323K；Shimadzu），分光光度计（SHIMADZU UV‐1800），pH计（Schott pH‐Meter CG840；Zevenhuizen），振荡器（IKA KS 130 basic），涡旋器（Fisons whirli‐mixer，Akribis Scientific Limited），自动移液器（Eppendorf），振荡器midi dual 14（Akribis Scientific Limited），磁力搅拌器（Daihan，WiseStir MSH‐20A），纯水装置（Barnstead Easy Pure UV/UF），水浴Core（HistoCore

资助

本研究未获得任何资金支持。

数据可用性声明

本研究期间生成和分析的数据包含在本已发表的文章中。额外数据可应通讯作者合理要求提供。

稿件准备过程中生成式人工智能及AI辅助技术的声明

在准备本工作期间，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来改善稿件的语言、语法、可读性和组织结构。使用该工具后，作者仔细审阅、编辑和核对了所有内容，并对稿件最终版本承担全部责任。

作者贡献

Z. K. 构思并监督了整体研究，负责进行动力学研究。S. U. 和F. T. E. 负责目标席夫碱分子的合成及其表征。P. G. 进行了分子对接研究，开展计算研究以阐明结合机制。F. S. 进行了抗癌实验，评估了化合物的细胞毒性。B. T. 进行了抗菌

CRediT作者贡献声明

Behiye Ta?er：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，方法论，形式化分析。Fatma Sa??r：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，验证，方法论，调查。Zeynep K?ksal：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，监督，项目管理，方法论，调查，形式化分析，概念化。Seda ünlü：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，方法论，调查。Fikriye Tuncel Elmal?：写作

利益冲突声明

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

感谢伊斯坦布尔梅地耶特大学B?LTAM研究中心提供实验室空间。

Behiye Ta?er|Fatma Sa??r|Zeynep K?ksal|Seda ünlü|Fikriye Tuncel Elmal?|P?nar Güller