引言
碱性磷酸酶（ALP）是一种存在于多种人体组织中的金属酶，包括肝脏、肾脏、肠道、骨骼和胎盘[[1], [2], [3]]。它催化多种磷酸底物的磷酸基团水解，在碱性pH（9-10）时活性最大[2,4]。该酶参与基本的生理过程，尤其是骨骼矿化、磷酸盐跨膜转运和代谢[4]。因此，ALP被广泛用作临床标志物，用于诊断和监测肝脏疾病、骨骼疾病和某些肿瘤性疾病，在骨病变和肝脏转移中常观察到其水平升高[[5], [6], [7], [8], [9], [10]]。虽然基于分光光度法、荧光法和ELISA的常规碱性磷酸酶（ALP）检测通常具有良好的分析性能，但由于需要大型光学仪器、多步孵育和洗涤步骤以及长达数十分钟的分析时间，它们在快速检测或即时检测中的适用性受到限制[1,4,11,12]。
电化学生物传感器是一种有吸引力的替代方案，因为它们易于使用、成本低且能通过将生物事件转化为可测量的电信号来实现实时检测[[13], [14], [15], [16]]。石墨烯、银和金纳米颗粒以及多壁碳纳米管（MWCNTs）等纳米材料已被广泛用于提高光学和电化学ALP传感器的灵敏度[[17], [18], [19], [20]]。MWCNTs具有高比表面积、机械强度和强的电子迁移率，能够实现更快的电子转移[21]。壳聚糖是一种生物相容且可生物降解的生物聚合物，其氨基基团可与生物分子相互作用[[22], [23], [24], [25]]，能够固定生物分子（包括酶和抗体），同时保持其结构和活性[[26], [27], [28]]。与MWCNTs结合后，可制备出电荷转移电阻低于未修饰电极的传感器[[29], [30], [31], [32]]。MWCNTs与壳聚糖在电化学生物传感器中的结合显示出制备高性能生物传感器的巨大潜力，该传感器可检测包括碱性磷酸酶在内的多种分析物[[33], [34], [35]]。ALP也已被广泛用作电化学免疫传感器中的酶标记物[33]。
ALP抑制也是临床生物化学和生物传感器验证的重要组成部分。由于乙二胺四乙酸（EDTA）具有强效结合Zn2?和Mg2?等二价金属离子的能力，因此它是ALP的已知抑制剂[[36], [37], [38]]。由于ALP需要这些离子来维持结构完整性和活性，它们的螯合会导致无金属的不活化酶产生[39,40]，据报道EDTA结合引起的结构变化会改变活性位点并阻止底物结合[[41], [42], [43]]。随着EDTA浓度增加，ALP活性下降[[44], [45], [46]]。已使用带有固定ALP的电化学平台研究ALP抑制并在复杂基质中检测抑制剂[47,48]。
虽然ALP的生物化学和电化学表征已有大量研究，但底物识别和抑制的原子级细节仍未得到充分表征，尤其是PNPP、苯酚和EDTA如何与ALP活性位点相互作用（氢键网络、疏水接触和金属配位几何构型）。分子对接和全原子MD模拟可以在原子分辨率下提供此类信息[[49], [50], [51], [52]]。
因此，本研究结合了电化学和计算方法。我们制备了MWCNTs/壳聚糖修饰的玻璃碳电极以固定BSA–ALP，并通过DPV研究其对PNPP的响应和EDTA的抑制效应。同时，使用AutoDock Vina对接和GROMACS中的100 ns全原子MD模拟，结合MM/PBSA结合自由能分解，比较了PNPP、苯酚和EDTA在人胎盘碱性磷酸酶（PALP）活性位点内的结合情况。据我们所知，尚未有相关平台报道EDTA对ALP抑制的电化学评估。
Roumaissa Mahdjoubi|Mebarka Bouziane|Ahmed Boufissiou|Wafa Zahnit|Belkhalfa Hakim
