《Journal of Invertebrate Pathology》：Purification, molecular characterization, and bioinformatics analysis of putative antimicrobial peptides isolated from the haemolymph of the mulberry silkworm,
Bombyx mori
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•从家蚕血淋巴中纯化了抗菌肽。•RP-HPLC 和 LC-ESI-MS 鉴定出五种不同的 AMP 组分。•这些肽表现出此前未报道过的独特氨基酸序列。•肽具有独特的序列，质量范围为 1999 至 3777 Da。•四种 AMP 本质上呈线性、胞质性和两亲性。•一种 AMP 含有
• 从家蚕血淋巴中纯化了抗菌肽。
• RP-HPLC 和 LC-ESI-MS 鉴定出五种不同的 AMP 组分。
• 这些肽表现出此前未报道过的独特氨基酸序列。
• 肽具有独特的序列，质量范围为 1999 至 3777 Da。
• 四种 AMP 本质上呈线性、胞质性和两亲性。
• 一种 AMP 含有跨膜螺旋和 N-糖基化位点。
• 结构特征表明具有强烈的膜破坏活性，支持其潜在的膜破坏性抗菌活性。
引言 Bombyx mori L.（鳞翅目：蚕蛾科），家养桑蚕，既是实验上易于操作的鳞翅目模型，也是商业丝绸的主要来源。其经济重要性源于蚕茧和生丝的生产，支持基于养蚕业的生计和纺织价值链。其测序基因组、明确的发育阶段以及广泛的遗传和生理资源，也使其适用于发育、宿主 - 病原体相互作用和先天免疫的研究（Tanaka 等，2008；Ashraf 和 Qamar，2023）。
昆虫主要依赖先天免疫防御。微生物识别后，会通过 Toll 和免疫缺陷相关信号通路激活转录反应，如抗菌肽，并通过细胞外丝氨酸蛋白酶级联引发黑色素化和其他体液反应（Lemaitre 和 Hoffmann，2007；Kanost 和 Jiang，2015；Yi 等，2014）。在家蚕中，已表征的肽家族包括塞克罗宁、莫西辛、防御素、勒博辛、阿塔辛和格洛弗宁。这些分子在大小、电荷、二级结构和微生物谱系上各不相同，许多是在感染或免疫挑战后诱导产生的（Hara 和 Yamakawa，1995；Tanaka 等，2008）。氨基酸组成是许多抗菌肽行为的关键。赖氨酸和精氨酸等基本残基可促进与带负电荷的微生物表面的静电结合，而亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸则提供与脂双层的疏水接触。然而，抗菌功能不能从组成甚至预测结构中推断：活性取决于浓度、构象、聚集、膜组成和毒性，必须通过实验确定（Lei 等，2019；Bui Thi Phuong 等，2024）。公开序列资源，包括 SilkDB（
https://silkdb.bioinfotoolkits.net/ ）、NCBI 蛋白（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ ）和 UniProt（
https://www.uniprot.org/ ），支持比较肽分析。计算工具可以补充实验表征，描述残基组成、疏水性、拓扑结构和可能的构象。然而，预测是假设而非生物活性的证据。
本研究的目的是通过 RP-HPLC 方法从未经挑战（粗制）和大肠杆菌挑战的家蚕幼虫血淋巴中纯化低分子量肽组分。通过 LC-ESI-MS 获得候选分子量和序列，并使用 PepDraw、Protter、PEP-FOLD、PEPTIDE 2.0 和 ProtScale 预测其理化及结构性质。
章节摘要 家蚕饲养和实验组 Nistari 多化性B. mori 幼虫以每天供应三次的 fresh 桑（Morus spp.）叶饲养。早期龄期保持在 27–28 °C 和 80–85% 相对湿度，后期龄期保持在 22–24 °C 和 60–70% 相对湿度，光周期为 12 小时光照：12 小时黑暗。第五龄幼虫在第四次蜕皮完成后，通过饲养记录以及体型和摄食活动的特征性增加来识别。第三天的第五龄幼虫被分配
RP-HPLC 分级和候选肽谱 从每组收集了四个显著组分。SI 组分在 16.744 分钟 (SI-PI)、18.421 分钟 (SI-PII)、23.752 分钟 (SI-PIII) 和 41.527 分钟 (SI-PIV) 洗脱；SII 组分在 9.191 分钟 (SII-PI)、17.240 分钟 (SII-PII)、25.958 分钟 (SII-PIII) 和 27.796 分钟 (SII-PIV) 洗脱。选择了五个组分进行分子和计算表征。报告的分子量和暂定序列总结在表 1 中。(见图 1。)
讨论 昆虫主要依赖先天免疫，其中抗菌肽 (AMPs) 是抗入侵病原体的主要体液防御分子（Chakraborty 等，2021；Chakraborty 和 Dastidar，2022）。其产生主要受微生物识别后通过 Toll 和 IMD 通路的信号控制。这些通路激活转录因子和酶级联反应，控制活性肽的合成、蛋白水解加工并释放到血淋巴中。
结论 在本研究中，对照和大肠杆菌挑战的家蚕血淋巴的纯化 RP-HPLC 分离产生了五个具有不同分子和结构特征的肽组分。质谱分析、暂定序列分配、氨基酸组成、疏水性和构象建模表明这些组分之间存在相当大的理化多样性。亮氨酸、赖氨酸和精氨酸的富集，以及预测的两亲性和螺旋状
CRediT 作者贡献声明 Deeya Ghosh Dastidar: 写作 - 初稿，软件，资源，方法，调查。Barna Chakraborty: 写作 - 审查与编辑，可视化，监督，方法，调查。Suman Kumar Halder: 可视化，验证，资源，方法。Aveek Samanta: 可视化，软件，形式分析，数据整理，概念化。
资助 除上述已致谢的奖学金外，本研究未获得特定资助。
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
致谢 第一作者 Deeya Ghosh Dastidar 感谢印度政府教育部大学拨款委员会 (UGC) 授予的 Savitribai Jyotirao Phule 单身女童奖学金 (SJSGC-2022)。作者感谢来自维迪亚萨格尔大学、印度理工学院 (Kharagpur) 中央研究设施和加尔各答玻色研究所的机构和技术支持。
Deeya Ghosh Dastidar|Barna Chakraborty|Suman Kumar Halder|Aveek Samanta
