《Journal of Invertebrate Pathology》：From soil to target: Investigating the role of native entomopathogenic fungi as biocontrol agents against
Scaphoideus titanus ball (Hemiptera: Cicadellidae) in grapevines
编辑推荐：
昆虫病原真菌（EPF）是一类功能多样的土传微生物，在节肢动物种群的自然调控中发挥着重要作用，是可持续农业和有害生物综合治理（IPM）计划中的宝贵资源。在葡萄栽培中，Scaphoideus titanus Ball（半翅目：叶蝉科）作为葡萄金黄化病植原体（FDp
昆虫病原真菌（EPF）是一类功能多样的土传微生物，在节肢动物种群的自然调控中发挥着重要作用，是可持续农业和有害生物综合治理（IPM）计划中的宝贵资源。在葡萄栽培中，Scaphoideus titanus Ball（半翅目：叶蝉科）作为葡萄金黄化病植原体（FDp）的主要传播媒介，对欧洲葡萄园构成重大威胁。本研究从意大利皮埃蒙特地区的葡萄园、林地和休耕地土壤中分离获得了151株可培养的EPF分离物，归属于14个物种。以Euscelidius variegatus为模式昆虫进行定性筛选后，选取15株EPF菌株对S. titanus成虫开展致病性生物测定。结果显示，Metarhizium anisopliae BP1e表现出最强的致病力，处理后12天（DPT）S. titanus存活率仅为27.2%，风险比（HR）达19.4，显著优于阳性对照商品菌株Beauveria bassiana ATCC 74040（Naturalis?）；M. robertsii BP1k亦表现出良好效果（12 DPT存活率40.2%）。基于致病性结果筛选出9株菌株进一步开展内生定殖试验，其中Purpureocillium lilacinum CaS1a在葡萄叶片中表现出最高且最持久的内生定殖能力，处理后14天（DPT）处理叶定殖率达77.5%，未处理叶亦检测到22.5%的定殖率。研究表明，M. anisopliae BP1e与P. lilacinum CaS1a分别兼具优异的杀虫致病力和持久的内生定殖能力，二者具有互补的生物防治相关性状，为开发针对S. titanus的环境友好型、生态适配型害虫管理策略提供了重要基础。
论文解读
一、研究背景与科学问题
葡萄金黄化病（Flavescence dorée, FD）是欧洲葡萄园最具毁灭性的病害之一，由葡萄金黄化病植原体（FDp）引起，可导致叶片黄化或红化、坏死、卷曲、花序或果穗枯萎、木质化缺失，严重降低葡萄产量与品质，最终导致植株死亡。该病害的主要传播媒介为Scaphoideus titanus Ball（半翅目：叶蝉科），一种原产于北美、20世纪引入欧洲的单化性叶蝉，几乎专性取食Vitis属植物，现已扩散至意大利及欧洲大部分葡萄种植区。目前受感染地区强制要求反复施用化学杀虫剂，但面临日益严峻的生态、毒理学和抗药性挑战，亟需寻找可持续的替代方案。
昆虫病原真菌（EPF）作为一类重要的生物防治因子（BCA），不仅具有直接杀虫活性，还能以内生菌形式定殖于植物组织内部而不引起可见损伤，从而在不良环境条件下持续存活，诱导植物系统抗性，产生对植食性昆虫和病原具有驱避作用的代谢产物，并可作为EPF种群的长期储库。然而，内生定殖的成功与否高度依赖于真菌菌株、葡萄品种、植物生理状态和环境条件，因此菌株的精准筛选至关重要。本研究旨在从目标应用的地理区域和生态环境中分离本地EPF菌株，系统评估其对S. titanus的致病力及在葡萄植株中的内生定殖能力，为开发生态适配型生物防治策略提供科学依据。
二、研究设计与技术方法
研究人员于2022年3月至7月在意大利皮埃蒙特地区36个采样点（26个葡萄园、5个林地、5个休耕地）采集103份土壤样本，每份样本由3个相距10 m的采样点组成，采集深度为10–30 cm。采用两种互补方法分离EPF：选择性培养基直接涂布法和Galleria mellonella幼虫诱饵法。通过ITS区段测序进行分子鉴定，结合NCBI和CBS真菌数据库进行物种确认。以Euscelidius variegatus（与S. titanus同科同亚科、同为FDp传播媒介、可全年大量饲养的近缘模式叶蝉）为对象进行定性致病力初筛，从中筛选出15株菌株对S. titanus成虫开展定量致病力生物测定（每菌株5个微宇宙重复，每重复10头成虫，监测12天）。基于致病力结果，以12 DPT昆虫存活率60%为阈值筛选出9株菌株进行葡萄内生定殖试验，在3、7、14 DPT对处理叶和未处理叶分别取样，通过表面消毒后叶片圆盘培养法评估定殖率。数据分析采用Cox比例风险模型（以微宇宙为随机效应）和二元广义线性混合模型（GLMM）。
三、研究结果
3.1 EPF分离物：共获得226株真菌分离物，其中151株基于≥98% ITS序列相似性被鉴定为14种EPF物种。Metarhizium anisopliae为优势种（68株，占45.0%），其次为Purpureocillium lilacinum（38株，占25.2%）和M. robertsii（15株，占9.9%）。选择性培养基法和Galleria诱饵法分别获得84株（55.6%）和67株（44.4%），两种方法效率相当但物种回收偏好存在差异。生境分布呈现明显分化：M. anisopliae在林地和休耕地中检出率（90%）高于葡萄园（58%），M. robertsii在葡萄园中检出率（38%）高于林地和休耕地（10%），Penicillium citrinum仅从葡萄园土壤中分离获得。
3.2 生物测定：定性初筛中，151株EPF中有41株能在处理后7天（DPT）杀死全部10头E. variegatus成虫，以4 DPT死亡率至少60%为标准选出15株菌株。对S. titanus成虫的致病力测定显示菌株间差异显著（似然比检验：χ2=58.05，df=16，P<0.001）。M. anisopliae BP1e致病力最强，4和8 DPT存活率分别为30.7%和27.2%，风险比（HR）高达19.4，远优于阳性对照B. bassiana ATCC 74040（HR=8.25，12 DPT存活率46.3%）；M. robertsii BP1k（HR=9.47，12 DPT存活率40.2%）和P. lilacinum CaS1a（HR=8.95，12 DPT存活率50.7%）亦优于或接近阳性对照。B. bassiana Cg1k和B. pseudobassiana Cg2b的HR略低于阳性对照但最终累计死亡率相当。M. anisopliae BP1o、P. lilacinum CB2和C. rosea CaS1h的HR与阴性对照无显著差异，M. robertsii BP1f仅边缘显著。
3.3 内生定殖试验：内生定殖率在菌株间和时间点上均存在显著差异（菌株：χ2=74.16，df=8，P<0.001；时间：χ2=107.09，df=2，P<0.001）。所有菌株在处理后3天（DPT）即可在处理叶中检测到定殖。P. lilacinum CaS1a定殖率最高且最持久，7和14 DPT分别达79.2%和77.5%；P. citrinum CaS1d和M. anisopliae BP1r呈中等且相对稳定的定殖水平（后期保持50%以上）；B. bassiana Cg1k和B. pseudobassiana Cg2b定殖率较低且随时间下降。未处理叶中，P. lilacinum CaS1a和P. citrinum CaS1d在14 DPT分别达到22.5%和38.5%的定殖率，其余菌株仅为1.4%–11.4%。
四、讨论与结论
本研究表明，皮埃蒙特地区葡萄园生态系统中EPF分布广泛且呈现生境特异性分布格局，周边非作物生境对本地EPF种群动态具有重要影响。M. anisopliae BP1e和M. robertsii BP1k对S. titanus的防治效果显著优于商品化菌株B. bassiana ATCC 74040，进一步支持了Metarhizium属对半翅目害虫的高效性；B. bassiana Cg1k、P. lilacinum CaS1a和B. pseudobassiana Cg2b的致病力与Naturalis?相当，展示了本地EPF新菌株扩充现有生物防治产品库的潜力。本地适应性菌株因已自然存在于目标农业生态系统中，其应用可能强化现有生态调控过程而非引入外源微生物，这对生物农药监管和环境风险评估具有重要参考价值。值得注意的是，致病力与内生定殖能力在菌株间呈解耦趋势：M. anisopliae BP1e具有快速高效的杀虫活性，而P. lilacinum CaS1a在葡萄组织中的内生定殖最为持久，二者互补的生物防治相关性状提示了联合施用或序贯施用的策略潜力。然而，这两项特性是在独立试验中分别评估的，同一菌株或同一施用方案中二者的联合表达尚未在本研究中得到实验验证。研究人员同时指出，在目前开发阶段，EPF单独使用可能不足以在葡萄园中实现对S. titanus的充分控制，但真菌类产品可作为IPM计划中具有价值的补充工具。未来研究需重点开展田间验证、评估对非靶标生物的安全性、优化真菌制剂配方、探索联合或序贯施用策略，并开展同时针对S. titanus若虫和成虫阶段的综合田间试验。
