一种用于全面表征HPV 16型病毒样颗粒的平行SEC柱配置策略

《Journal of Chromatography A》：A Parallel SEC Column Configuration Strategy for Comprehensive Characterization of HPV Type 16 Virus-Like Particles

　　- 在产品开发的不同阶段鉴定HPV-VLP第16型。- 分辨VLP的不同分子阶段。- 通过与MALS联用实现绝对分子量测定。- 在30分钟内增强VLP物种的分离。## 引言类病毒颗粒（VLPs）是由病毒结构蛋白组成的多聚体蛋白复合物[1]。VLPs由于其反复展示抗原表位，能够引发体液免疫和细胞介导的免疫应答，同时由于缺乏病毒基因组而无法复制，使其成为更安全且治疗有效的疫苗[2,3]。人乳头瘤病毒是非包膜DNA病毒，其衣壳由主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2组成。L1蛋白可自组装为称为壳粒的五聚体，72个壳粒按二十面体晶格排列（T=7）[4]。HPV-VLPs是由重组结构L1病毒蛋白组装而成的分子集合体，大小范围为55至60纳米[5,6]。L1蛋白在多种宿主系统中被广泛重组表达，包括酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞系[[7], [8], [9], [10], [11]]。HPV VLP第16型可提供对抗宫颈癌的免疫力，并以不同的品牌名称（如Cervarix、Gardasil和Gardasil-9）商业化用于治疗，涵盖不同的血清型[[12], [13], [14]]。由于其在与重组宿主系统中合成，VLPs及其他工艺和产品相关杂质的表征是获得监管批准的必要前提。常用于表征类病毒颗粒（VLPs）的分析技术包括可视化技术，如显微镜技术，包括透射电子显微镜、扫描电子显微镜、原子力显微镜和冷冻电子显微镜，用于形态和尺寸评估[[15], [16], [17]]；生物物理技术，如动态光散射（DLS）和纳米颗粒追踪分析（NTA），用于分析粒径分布和胶体稳定性；以及色谱技术，用于效价和纯度的测定[[18], [19], [20], [21]]。色谱技术常与质谱联用，用于鉴定结构蛋白，以及光阻塞检测器如多角度光散射（MALS），用于测定完整VLP的尺寸和分子量[22,23]。尺寸排阻色谱（SEC）是分离蛋白质混合物的首选分析技术，根据其流体力学半径进行分离，通常与MALS联用以阐明蛋白质分子量[24]。HPV VLPs的表征包括检测和分离聚集体、单体VLPs（完整VLPs）、部分组装的VLPs以及游离的L1单体[22,25]。大多数用于分离治疗性蛋白质的SEC柱孔径较小，通常不适用于VLP分析，因为这些柱的排阻极限低于完整VLP，导致VLP在死体积中洗脱。大孔径柱广泛用于VLP的纯化和分析表征[23]。如Sepharose Big Beads SEC树脂，平均孔径约9.12 nm，以及Sephacryl 500 SEC，孔径范围约100至200 nm，广泛用于将完整类病毒颗粒（VLPs）与宿主细胞蛋白和其他工艺相关杂质分离[[26], [27], [28], [29]]。然而，这些大孔径树脂在区分寡聚体组装体与单体VLPs方面分辨率有限[30]。因此，它们并不适合评估VLPs的不同寡聚和组装状态，而这对于监测产品质量、结构完整性和工艺一致性至关重要[31]。这需要使用不同孔径的柱子进行多次运行，导致运行时间延长[32]。为解决这一问题，研究人员采用了非对称流场流分选（AF4），通过施加垂直于窄通道中流体流的力场（带有渗透性积累壁），实现无需固定相的VLP及其聚集体的分离（分辨率不受SEC柱孔径限制）[33,34]。聚焦过程中的强交叉流会变形VLPs，且由于VLPs与膜的相互作用，分析过程中也可能发生样品损失[35]。最近，二维液相色谱（2D-LC）因其增强的分辨率、峰容量和正交性而备受关注，可在减少共洗脱的同时提高灵敏度和鲁棒性[36]。使用具有不同分离机制或排阻极限的连续色谱步骤是大分子纯化的既定策略[[37], [38], [39], [40]]。例如，一项专利采用两步捕获策略，使用不同孔径的SEC柱，从而根据流体动力学尺寸实现对物种的互补分级[41]。同一原理可应用于VLPs的分析表征，方法是结合具有不同分离机制的色谱维度。这可通过二维液相色谱（2D-LC）实现，即第一色谱维度的组分接受第二分离[42,43]，或通过T型接头在单一色谱构型中将两个柱子串联[[42], [43], [44]]。研究人员在2D-LC中串联MALS，整合了两个不同孔径的SEC柱，用于分辨VLPs的不同尺寸变体，其中第一维度使用250 ?孔径的SEC柱分离L1/寡聚体，第二维度使用2000 ?孔径的SEC柱分析聚集体和完整VLPs。尽管报告的2D-LC方法总运行时间约为12分钟，但MALS检测器仅连接至第二维度柱，且分析仅涉及从第一维度进行一次心切。由于第二维度柱上每次心切的分析需要约6分钟，要对从第一维度洗脱的所有物种进行表征，需要进行多次心切，从而显著增加总分析时间。因此，所报告的12分钟运行时间并不代表对第一维度所有峰进行全面MALS分析[31]。Arcinas等人使用2D-LC串联UV和荧光检测器，在细胞裂解液中定量测定L1单体，第一维度为SEC，第二维度为反相色谱，通过二硫苏糖醇和十二烷基硫酸钠洗涤剂将L1蛋白寡聚体进行还原和变性[45]。类似地，第一维度为SEC、第二维度为反相色谱并串联MS的2D-LC已被证明能够在VLP生产的各个阶段实现对壳粒、尺寸变体和宿主细胞蛋白的鉴定、效价测定和确认[46]。串联柱色谱用于在串联构型中高效分离包膜VLPs（委内瑞拉马脑炎病毒类颗粒）与污染的宿主细胞蛋白，其中阴离子交换（AEX）柱用于将疫苗颗粒与其他HCPs分离，SEC柱通过PEEK耦合器与AEX柱串联，根据尺寸分离VLPs和中间产物[47]。尽管具有这些优势，2D-LC仍需要较长的运行时间、复杂的仪器、高成本以及劳动密集的方法开发[48]，且串联构型由于高压和峰展宽而受到限制。在本研究中，我们提出了一种单维度色谱技术，在不具备2D-LC复杂性的情况下实现了类似的分离选择性。与标准2D-LC 45-50分钟的运行时间相比[32,33]，该方法通过在平行构型中通过T型接头将两个不同孔径的SEC柱串联，在30分钟内实现了所有VLP构象状态的彻底分离，不同于2D SEC-SEC MALS，后者仅从第二维度提供物种的分子量[45,46]## 章节摘要### 材料HPV-VLP第16型L1蛋白合成基因被编码到毕赤酵母细胞中。基因翻译由AOX1启动子调控，以甲醇作为诱导剂。本研究利用了不同工艺阶段的HPV-VLP第16型样品。粗VLP样品（含毕赤酵母细胞裂解液）使用直径13 mm的0.2 μm注射器过滤器（Axiva，目录号：SFNY13RB）进行过滤，随后以14,000 rpm离心3分钟。纯VLP样品为### 2000 ?孔径SEC柱串联MALS分析大孔径SEC柱是表征VLPs的首选分析方法，因为它们能够容纳VLPs较大的流体力学半径，并在分离过程中保持其复杂多聚体组装体的完整性[23,31,54]。此前，研究人员已成功使用2000 ?孔径SEC柱分辨了高分子量的HPV VLP颗粒（最高达20 MDa和250 kDa）。然而，未能有效分离低分子量蛋白（约50 kDa）[31,49]。在### 结论与未来工作VLPs在尺寸上表现出异质性，并在各种处理步骤中存在多种结构状态。通过SEC监测其寡聚化需要使用多个柱子，使过程耗时。在本文中，我们提出了一种创新分析平台，将两个不同孔径的尺寸排阻色谱（SEC）柱并联，使能在单次运行中分离类病毒颗粒（VLP）的不同分子物种，从而提供改进的### 作者贡献声明Vineela Peruri：概念构思、方法学、初稿撰写、审阅。Sunil Kumar：概念构思、方法学、验证、审阅与编辑。Anurag S. Rathore：监督、审阅与编辑、资金获取。### 资助VP感谢印度科学与工业研究理事会（CSIR）（档案号：09/0086(16582)/2023-EMR-I）提供奖学金。### 利益声明作者声明不存在已知的相互竞争的财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本论文所报告的工作。### CRediT作者贡献声明**Vineela Peruri：** 初稿撰写、方法学、研究、概念构思。**Sunil Kumar：** 初稿撰写、方法学、概念构思。**Anurag S Rathore：** 审阅与编辑、监督、资源、方法学、概念构思。### 竞争利益声明我们声明，我们与其他个人或组织之间不存在任何可能不当地影响我们工作的财务或个人关系，并且关于本论文的发表不存在利益冲突。### 致谢作者感谢印度理工学院德里校区COE-CBT实验室的Meenal和Rashmi Sharma在VLP样品的生产和纯化方面提供的帮助。Vineela Peruri|Sunil Kumar|Anurag S Rathore