基于微尺度文库合成与直接生物学筛选发现的首类双功能TLX激活剂

《Angewandte Chemie Novit》：Discovery of a First-in-Class Dual-Function TLX Activator by Microscale Library Synthesis and Direct-to-Biology Screening

　　

无尾同源物（TLX）是一种具有双重转录抑制和激活功能的转录因子，被认为通过维持神经干细胞（NSC）和视网膜祖细胞的增殖与分化平衡来调控其稳态。TLX调节可能提供对神经发生和视网膜细胞发育的药理学控制，在退行性病理中具有治疗潜力，但目前缺乏用于探索这一概念的TLX配体。本研究采用进化启发的配体开发策略，结合微尺度合成与直接生物学测试，获得了能够同时激活TLX抑制功能和其在TLX激活元件（TAE）上转录活性的强效激动剂。促进TLX抑制或激活特性的配体对受体二聚化和辅调节因子招募产生不同影响，从而为TLX调节提供了分子基础。在转录组学和表型研究中，TAE激活诱导了细胞周期基因程序，并促进了离体终末分化视网膜色素上皮细胞的细胞周期进入，这支持了TLX激动剂的再生潜力。

研究背景与科学问题

转录因子无尾同源物（TLX，即NR2E1）是神经干细胞（NSC）稳态的核心调控因子，维持NSC的自我更新状态并促进神经发生。TLX兼具转录激活和转录抑制的双重功能，通过调控细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（p21）和磷酸酶与张力蛋白同源物（pten）等关键细胞周期调控因子的表达，协调NSC和视网膜祖细胞的增殖与分化。体内敲除或过表达模型已证明TLX对行为、记忆功能和学习能力具有显著影响，并强调了其在神经发生和抗神经炎症中的重要性。小鼠NSC中靶向过表达TLX可增加新生神经元数量并增强学习记忆功能，突显了在阿尔茨海默病等神经病理中激活TLX的治疗潜力。然而，尽管TLX属于配体激活的转录因子家族，且已被证实可响应化学扰动，但强效调节剂极为稀少，药理学TLX调节的影响仍不明确。TLX配体的发现受到高质量结构数据缺乏、受体不稳定及其独特的双重激活/抑制活性的阻碍。虽然研究人员近期开发了一种增强TLX抑制活性的配体骨架，但能够同时激活TLX在TLX激活元件（TAE）上转录活性的调节剂仍然缺失。

研究目标与策略

为填补这一空白，研究人员采用进化启发的策略，广泛探索TLX配体空间，以期发现能够完全激活TAE的全效TLX激动剂。从弱片段TLX配体出发，研究人员进行了多轮循环的微尺度文库合成（25 μmol）和直接生物学细胞筛选，每轮循环中“突变”不同的子结构。该方法最终获得了一种具有纳摩尔级效力且TAE激活效能极强的TLX激动剂。研究结果证实存在两种类型的TLX激动剂，它们通过TLX的抑制功能和TAE激活介导不同的转录组效应，并在TLX二聚化和辅调节因子招募的分子水平上也存在差异。转录组学和表型研究表明，TAE激活对细胞周期调控和增殖具有显著影响，其中TAE激活型TLX激动剂4.8能够在离体条件下促使终末分化的视网膜色素上皮细胞进入细胞周期。

关键技术方法

研究人员采用迭代式微尺度文库合成与直接生物学（D2B）筛选相结合的方法。具体而言，通过酰胺偶联反应在微尺度格式下制备配体候选物文库，经LC-MS验证产物形成后，直接在两种细胞报告基因检测系统中进行单点测试，分别评估对TLX抑制活性和TAE活性的影响。每轮优化迭代中降低测试浓度以增强选择压力，最活跃的命中化合物经批量制备和全剂量-响应曲线验证后作为下一轮优化的种子。整个研究共制备并测试了350种TLX配体候选物，历经四轮迭代优化。

研究结果

2.1 通过进化启发的微尺度化学开发TLX调节剂

第一代微尺度文库（192种化合物，30 μM测试）仅获得一个双重TLX激活命中化合物1.157，其在Gal4-TLX和TAE检测中均表现出强效活性（EC₅₀均为7 μM），TAE最大激活倍数为8.2倍，并通过等温滴定量热法（ITC）验证了与TLX配体结合域（LBD）的直接结合（K_d 3.4 μM）。以1.157的6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉子结构为种子，第二代文库（117种化合物，10 μM测试）获得四个命中化合物，效力相比1.157提升高达14倍。第三代文库对2.66的四氢异喹啉部分进行精细探索（3 μM测试），虽未实现效力优化但获得了额外骨架。第四代文库对甲酰胺基序进行精细调整，最终获得具有纳摩尔级TLX激动活性和8.6倍TAE激活效能的化合物4.8。通过亲和选择质谱法（ASMS）确认了4.8与TLX LBD的结合。基于四轮优化的构效关系（SAR）知识，研究人员设计了仅激活TLX抑制功能的结构匹配参照化合物5.8和完全无活性的参照化合物5.4。在25种核受体的广泛选择性筛选中，4.8和5.8展现出良好的TLX调节选择性。

2.2 配体调节TLX二聚化和辅调节因子结合

生物层干涉测量法（BLI）显示，4.8和5.8均能稳定TLX同源二聚体，其中4.8的效果显著更强。TLX与辅阻遏物NSD1的相互作用在5.8存在下亲和力提高一倍（K_d从3.7 μM降至2.0 μM），而4.8对此无影响。对于多种辅激活因子（SRC-1、TIF2、AR N-term、ARA70、NRIP1），4.8和5.8均使TLX与其的相互作用减弱约两倍，但两种配体间无显著差异。

2.3 TLX/TAE激活诱导细胞周期和能量产生相关基因程序

在ARPE-19视网膜色素上皮细胞中进行转录组学分析，4.8（0.1 μM）显著改变了1091个基因的表达，5.8（3 μM）影响了145个基因，其中85个为共同靶标。主成分分析和相关性分析显示两组处理具有共同和差异性的转录效应。基因集富集分析（GSEA）表明，核糖体和氧化磷酸化相关通路是两者的共同主要调控通路。而细胞周期和增殖相关基因簇仅被4.8强烈影响，表现为细胞周期促进基因（如CCNB1、AURKA、PLK1）上调和细胞周期阻滞基因（如CDKN2B）下调，同时伴随抗凋亡基因（BIRC5、TRIAP1）和DNA修复基因（RAD51）的诱导。线粒体呼吸、氧化磷酸化和ATP生成相关基因（如NDUFA2、COX8A、ATP5MJ）则被两种配体共同上调。

2.4 TLX/TAE激活在体外促进细胞周期

细胞周期分析显示，4.8处理24小时后ARPE-19细胞中G2/M期细胞比例显著增加，而5.8和无活性参照5.4无此效果。延长处理至48小时进一步增加G2/M期细胞，而短时间处理（12小时）后撤药则可恢复基线水平，表明持续TAE激活导致可逆的G2/M期停滞。在间歇性给药方案（6小时处理/24小时循环）下，4.8处理的细胞融合度显著增加，表明TAE激活促进了细胞增殖。

2.5 TLX/TAE激活在离体条件下刺激视网膜色素上皮细胞进入细胞周期

在成年小鼠视网膜色素上皮（RPE）外植体中，4.8处理48小时后Ki67阳性细胞数量显著增加，而无活性参照5.4无此效果。总细胞数未增加，可能与成熟RPE细胞缓慢的细胞周期速率有关。细胞形态指标（致密度、偏心率、面积）未受影响。

研究结论与意义

TLX是神经和视网膜健康的关键因子，被认为能维持大脑和眼中特定干细胞群的完整性和增殖状态，并可能激活再生程序，因此是退行性疾病中颇具吸引力的药物靶点。本研究通过进化启发的微尺度模拟库策略，在广泛的化学空间搜索中开发了TLX调节剂。经过四轮文库迭代筛选共350种化合物，鉴定出4.8作为一种强效且选择性的激动剂，能够同时激活TLX的转录激活和抑制机制。值得注意的是，虽然多种化合物对TLX的抑制功能表现出激动活性，但鉴定同时刺激受体在TAE上激活特性的配体极具挑战性，这表明TLX独特的双重转录调控特性可通过配体进行选择性靶向。利用TAE激活型TLX激动剂4.8、仅激活TLX抑制功能的类似物5.8以及无活性参照5.4作为前所未有的工具，研究人员测试了TLX激活的分子、转录组和表型后果。研究发现配体改变了TLX的二聚化以及辅阻遏物和辅激活物的招募，为TLX调节提供了机制见解。TAE激活型TLX激动剂4.8强力稳定TLX同源二聚体，而TLX抑制活性激活剂5.8主要增强辅阻遏物NSD1的结合。在人RPE细胞中，TLX调节剂刺激了两个主要基因程序：线粒体呼吸、氧化磷酸化和ATP生成基因的激活是4.8和5.8的共同作用，而细胞周期基因诱导仅见于4.8，表明该效应依赖于TAE。与此一致，人RPE细胞在4.8处理后表现出增加的细胞周期活性，将转录组和表型效应联系起来。最重要的是，4.8还刺激了小鼠RPE外植体中的细胞周期进入，支持了研究结果的转化相关性。观察到的细胞周期进入刺激作为TAE激活的主要结果，与TLX在维持关键细胞群增殖状态中的假定角色高度一致，表明药理学TLX激活可能是通往再生治疗的一条潜在途径。