通过顺序能量封锁逆转肿瘤-免疫代谢竞争，以重新激活耗竭T细胞增强癌症免疫疗法

《Journal of Controlled Release》：Reversal of tumor-immune metabolic competition via sequential energy blockade to reactivate exhausted T cells for enhanced cancer immunotherapy

　　

摘要

癌症免疫疗法的有效性通常受限于肿瘤-免疫代谢竞争。代谢阻断疗法面临代谢可塑性的挑战，而同时给药则受到ATP依赖性药物和离子外排的制约。在此，我们开发了一种肿瘤微环境（TME）可激活的蛋黄壳纳米反应器，该反应器由过氧化钙（CP）核、负载WZB117（WZB）的空腔、中空介孔Cu-3,3′-二硫代双（丙酰肼）壳（HMCT）以及透明质酸（HA）涂层组成（CP-WZB@HMCT@HA），以实现"先饿后攻"的序贯能量阻断策略。CP-WZB@HMCT@HA在酸性和富含GSH的TME下通过时空级联被激活。首先，二硫桥壳降解释放Cu物种以消耗GSH，使肿瘤细胞对氧化应激敏感化。关键在于，GLUT1抑制剂WZB的早期释放抑制糖酵解，导致ATP快速耗竭，从而抑制外排泵并增加治疗药物的细胞内滞留。随后，钙过载和铜介导的活性氧（ROS）生成破坏线粒体稳态。这种序贯能量阻断诱导肿瘤能量耗竭，升高细胞外葡萄糖水平，并减少乳酸积累。因此，免疫抑制因子（PD-L1/TGF-β1）下调，重新激活耗竭T细胞的抗肿瘤免疫能力。体外和体内评估证明了抗肿瘤活性和可接受的生物相容性。该策略为重塑肿瘤-免疫代谢竞争和改善癌症免疫疗法提供了潜在途径。

引言

目前，以免疫检查点抑制剂（ICIs）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）为代表的临床免疫疗法已经彻底改变了癌症治疗的格局[1], [2], [3], [4], [5]。然而，它们在实体瘤中的治疗效果仍然有限，只有少数患者能够实现持久缓解[6]。主要障碍在于肿瘤免疫抑制微环境（TIME），它形成了物理和代谢屏障，阻碍了T细胞的浸润和功能[7], [8], [9]。一个关键原因是，快速增殖的肿瘤细胞与浸润的细胞毒性T细胞之间对营养物质（如葡萄糖）的激烈竞争导致T细胞功能耗竭，从而使标准免疫疗法失效[10]。因此，逆转肿瘤-免疫代谢竞争至关重要。

近年来，靶向和阻断肿瘤细胞异常能量代谢已成为一种有前景的治疗策略[11], [12]。然而，癌细胞的代谢可塑性使它们能够在单一通路被抑制时，适应性地从糖酵解转向线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）[13], [14]。因此，同时阻断胞质糖酵解和破坏线粒体呼吸的双重锁定策略对于诱导肿瘤细胞完全能量耗竭至关重要[15], [16], [17]。然而，目前的协同策略通常依赖多种治疗药物的同时递送，这往往忽视了一个关键的生物学屏障，即细胞内ATP水平最初足以维持ATP依赖性药物或离子外排泵（如P-gp、ATP7B和PMCA4）的活性[18], [19], [20], [21], [22]。这使得肿瘤细胞能够减少治疗分子和离子的细胞内滞留，从而削弱治疗效果的持久性[23], [24], [25]。

为解决这些挑战，在本研究中，我们提出了一种"先饿后攻"的序贯能量阻断策略来逆转肿瘤-免疫代谢竞争，以重新激活耗竭的T细胞，从而增强癌症免疫疗法。为实现这一策略，我们设计并构建了一种透明质酸（HA）修饰的、负载WZB117（WZB）的蛋黄壳纳米反应器，其包含过氧化钙（CP）核和中空介孔Cu-3,3′-二硫代双（丙酰肼）（TPH）壳（HMCT）（记为CP-WZB@HMCT@HA，图1a）。与紧凑的核壳结构相比，蛋黄壳架构提供了一个WZB负载空腔，将CP核与响应性Cu-TPH壳分离。这种空间分离支持早期代谢抑制，随后是渐进性核暴露和离子介导的细胞内损伤。通常，CP纳米颗粒被用作内核，并包覆一层二氧化硅纳米颗粒（SiNPs），其仅作为可去除的牺牲性硬模板。SiNP层支撑外壳的形成并定义内腔，但在最终纳米反应器中不具有治疗功能。CP通过产生Ca2?和H?O?在酸性TME中作为线粒体破坏组分。随后，通过Cu2?与含二硫键的TPH的原位配位在模板表面生长出介孔有机金属壳。TPH作为形成Cu-TPH壳所需的结构配体，同时其二硫键提供了GSH响应性降解能力。引入的Cu2?既作为结构交联剂，又作为GSH消耗的功能性试剂。选择性地蚀刻掉SiNP模板后，形成了具有内腔的蛋黄壳结构纳米颗粒（CP@HMCT）。这种独特的空腔结构随后被用于负载葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）抑制剂WZB以实现初始糖酵解阻断。最后，通过酰胺化反应将HA接枝到CP-WZB@HMCT表面以促进CD44介导的细胞摄取。

如图1b所示，静脉给药后，CP-WZB@HMCT@HA的肿瘤积累可能部分得益于EPR效应带来的被动沉积。HA功能化随后促进肿瘤细胞通过CD44介导的摄取[26], [27], [28]。在酸性且富含GSH的TME条件下，二硫桥外壳的降解使Cu2?释放并逐渐暴露负载WZB的内腔。因此，Cu2?和WZB在早期部分重叠的阶段释放，随后是CP核的延迟降解。释放的Cu2?消耗细胞内GSH并削弱肿瘤细胞的抗氧化防御系统（途径1），而WZB阻断GLUT1，抑制葡萄糖摄取并抑制糖酵解（途径2）。由此导致的细胞内ATP供应显著减少抑制了ATP依赖性外排泵，从而显著增强了药物在肿瘤细胞中的滞留。随后产生的Ca2?和H?O?与由FDX1/GSH还原Cu2?产生的Cu?一起破坏线粒体稳态并抑制三羧酸循环（TCA循环）和OXPHOS（途径3）。

上述途径共同破坏肿瘤细胞的ATP产生，导致能量耗竭。这种代谢重编程可以增加细胞外葡萄糖浓度，减少乳酸积累，并下调免疫抑制蛋白（PD-L1）和细胞因子（TGF-β1），为恢复免疫细胞活性创造有利条件。来自细胞和动物模型的实验证据表明，CP-WZB@HMCT@HA可以逆转肿瘤细胞与免疫细胞之间的代谢竞争，从而重新激活耗竭T细胞的抗肿瘤活性。此外，这种"先饿后攻"的序贯能量阻断策略在所测试的癌症模型中显示出治疗活性，可能为癌症免疫疗法提供潜在途径。

章节摘要

材料与试剂

无水氯化钙（CaCl?）、氢氧化钠（NaOH）、过氧化氢（H?O?）以及透明质酸（HA，M_w = 10–20 KDa）购自国药化学试剂（中国上海）。醋酸铜水合物（≥ 98%）、二甲基亚砜（DMSO，≥ 99.7%）、无水乙醇（CH₃CH₂OH，≥ 99.7%）、氨水（≥ 28%）、L-抗坏血酸（≥ 99%）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，M_w = 40 KDa）、5,5′-二硫代双-2-(硝基苯甲酸)（DTNB）、WZB117（WZB，≥ 99%）、正硅酸乙酯（TEOS，≥

CP-WZB@HMCT@HA的制备、结构与组成分析

为实现序贯药物释放，纳米颗粒通过硅模板法合成了蛋黄壳结构[29]（图1a）。首先，通过水解沉淀法[30], [31]使用200至25.0 mg/mL的CaCl?溶液合成了粒径不同的CP1-4纳米颗粒（表S1）。如图S1所示，25.0 mg/mL的CaCl?溶液由于其浓度过低而无法形成纳米颗粒。因此，CP3（图1b）纳米颗粒具有最小的

结论

为克服肿瘤代谢可塑性和ATP依赖性药物及离子外排所施加的治疗障碍，本研究开发了一种蛋黄壳纳米反应器CP3-WZB3@HMCT@HA2来执行"先饿后攻"的序贯能量阻断策略。该策略旨在减轻肿瘤-免疫代谢竞争并提高耗竭T细胞的抗肿瘤活性。结构和组成分析证实了蛋黄壳结构的成功构建

CRediT作者贡献声明

范清灯（Qingdeng Fan）：撰写-初稿、可视化、软件、方法论、调查研究、形式分析、数据管理、概念构思。黄雅（Ya Huang）：可视化、验证、方法论、调查研究、形式分析。陈鑫宇（Xinyu Chen）：可视化、验证、调查研究、形式分析。陈春梅（Chunmei Chen）：可视化、验证、调查研究、形式分析。任斌（Bin Ren）：可视化、验证、方法论、调查研究。朱佳阳（Jiaoyang Zhu）：可视化、验证、方法论。马龙（Haolong Ma）：

竞争利益声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究的经济支持来自国家自然科学基金委员会（32271374、32501164、82473348、82303797）、广东省自然科学基金（2024A1515012639）和广州市重点领域研发计划（2025B01J3007）。本研究严格按照南方医科大学发布的《实验动物管理和使用指南》进行。实验方案经过了严格的审查和

范清灯 | 黄雅 | 陈鑫宇 | 陈春梅 | 任斌 | 朱佳阳 | 马龙 | 杨晶 | 黄琳 | 熊伟 | 闫成功 | 梁冬燕 | 刘丹 | 蔡柳 | 宁世鹏 | 沈哲宇