《Journal of Controlled Release》：Rationally designed negatively charged lipid nanoparticles reduce systemic reactogenicity of mRNA vaccines while preserving immunogenicity
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基于信使RNA（mRNA）的药物开发迅速扩展，使其能够应用于多种疾病。例如，mRNA疫苗可诱导强效的体液免疫和细胞免疫应答，并已成为重要的疫苗平台。尽管mRNA疫苗具有强大的免疫原性，但其常引起全身性不良反应（如发热和疲劳）和局部反应原性（如注射部位疼痛和肿胀
基于信使RNA（mRNA）的药物开发迅速扩展，使其能够应用于多种疾病。例如，mRNA疫苗可诱导强效的体液免疫和细胞免疫应答，并已成为重要的疫苗平台。尽管mRNA疫苗具有强大的免疫原性，但其常引起全身性不良反应（如发热和疲劳）和局部反应原性（如注射部位疼痛和肿胀）。值得注意的是，这些反应在加强免疫后的发生频率和严重程度往往随抗原特异性免疫应答的增强而增加。此外，罕见但严重的事件（如心肌炎）在mRNA疫苗接种后亦有报道。此类反应原性仍是治疗性癌症疫苗面临的主要障碍，后者通常需要比传染病疫苗更高剂量和更频繁的重复接种，且其与其他免疫疗法（如免疫检查点抑制剂）联用可能进一步加剧全身性炎症反应。脂质纳米颗粒（LNP）通过激活先天免疫通路，可能对mRNA疫苗的反应原性产生重要贡献。研究人员既往证明，特定细胞因子（尤其是白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））是mRNA疫苗接种后发热的主要介导因子。因此，优化LNP配方是降低反应原性的有前景的策略。在本研究中，研究人员旨在通过修饰磷脂组分生成负电荷LNP，并在小鼠中全面评估其经肌肉注射作为mRNA疫苗后的生物分布、免疫原性和不良反应。研究结果表明，阴离子磷脂可实现负电荷LNP的工程化；负电荷LNP降低了炎症、发热和心肌肌钙蛋白I水平；尽管反应原性降低，抗原特异性免疫原性得以维持；反应原性降低与肝脏LNP递送减少相关；表面电荷控制可在保持免疫原性的同时降低反应原性。
一、研究背景与问题
信使RNA（mRNA）药物的开发近年来迅速扩展，mRNA疫苗可诱导强效的体液和细胞免疫应答，已成为重要的疫苗平台。在COVID-19疫苗成功之后，mRNA疫苗已被开发用于多种病原体，包括呼吸道合胞病毒和流感病毒。此外，mRNA疫苗正被积极探索作为癌症疫苗，以诱导肿瘤抗原特异性T细胞应答。
然而，尽管mRNA疫苗具有强大的免疫原性，其常引起全身性不良反应（如发热和疲劳）和局部反应原性（如注射部位疼痛和肿胀）。这些反应在加强免疫后的发生频率和严重程度往往随抗原特异性免疫应答的增强而增加。此外，mRNA疫苗接种后还报道了罕见但严重的事件，如心肌炎。此类反应原性仍是治疗性癌症疫苗的主要障碍，后者通常需要比传染病疫苗更高剂量和更频繁的重复接种，且与其他免疫疗法（如免疫检查点抑制剂）联用可能进一步加剧全身性炎症反应。此外，人体和动物模型研究表明，部分经肌肉注射的mRNA疫苗可分布至注射部位以外的循环和其他器官，但疫苗组分在脱靶组织中的生物学后果尚不完全清楚。因此，减少不良反应是mRNA疫苗领域的关键目标。
脂质纳米颗粒（LNP）通过激活先天免疫通路，可能对mRNA疫苗的反应原性产生重要贡献。空载LNP（不含mRNA）也能触发炎性细胞因子产生、注射部位局部炎症以及发热等全身性反应。研究人员既往证明，特定细胞因子（尤其是白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））是mRNA疫苗接种后发热的主要介导因子。因此，优化LNP配方是降低反应原性的有前景的策略。
LNP通常由四种主要组分构成：可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）缀合脂质。可电离脂质已被广泛优化，因其影响mRNA包封和内体逃逸，并可驱动先天免疫刺激。研究人员既往还证明，采用可生物降解的可电离脂质可降低炎症反应并减少不良反应，同时保持强健的抗原特异性免疫。在非可电离组分中，磷脂是结构多样的分子，其酰基链长度、不饱和程度和位置以及头基化学的变化可显著影响LNP的理化性质和生物学应答。磷脂工程为调节LNP表面电荷提供了实用手段，颗粒表面电荷可改变其在体内的命运，电荷控制可实现器官选择性递送。然而，这些见解主要基于为基因治疗开发的静脉递送范式。电荷修饰LNP对经肌肉注射的mRNA疫苗的生物分布、免疫原性和反应原性的影响仍缺乏充分表征。
二、研究内容与结论
本研究旨在通过修饰磷脂组分生成负电荷LNP，并在小鼠中全面评估其经肌肉注射作为mRNA疫苗后的生物分布、免疫原性和不良反应。研究人员制备了包含常规配方（SM-102/DSPC/胆固醇/PEG2k-DMG，摩尔比50:10:38.5:1.5，命名为DSPC-LNP）以及用阴离子磷脂替换中性磷脂DSPC的多种LNP配方，包括DSPA-LNP、DSPS-LNP、DOPC-LNP、DOPA-LNP和DOPS-LNP。研究发现，含阴离子磷脂的LNP表现出强负Zeta电位（约?10至?30 mV）。在体外转染实验中，负电荷LNP的蛋白表达低于中性LNP，但在体内肌肉注射后，各配方在注射肌肉中的蛋白表达相当。在生物分布方面，负电荷LNP显著降低了肝脏递送和肝脏蛋白表达，而脾脏和引流淋巴结（dLN）中的分布和表达与常规LNP相当或有所变化。
在免疫原性评估中，研究人员用1 μg S蛋白mRNA（S-mRNA）负载的LNP对C57BL/6J和BALB/c小鼠进行两次肌肉注射免疫（第0天和第21天）。所有LNP配方诱导的S特异性免疫球蛋白G（IgG）抗体水平相当，S特异性CD8+ T细胞应答也相当。在流感血凝素（HA）mRNA疫苗中，DSPS-LNP诱导的HA特异性IgG和血凝抑制（HI）滴度与DSPC-LNP相当。在反应原性评估中，研究人员使用20 μg S-mRNA负载的LNP（每条腿10 μg mRNA）进行免疫。常规DSPC-LNP在初次和加强免疫后均诱导显著的直肠温度升高，而负电荷LNP（DSPA-LNP、DOPA-LNP、DSPS-LNP和DOPS-LNP）显著抑制了发热。在血浆细胞因子分析中，DSPC-LNP诱导了大多数检测细胞因子的显著升高，而负电荷LNP显著减弱了这些应答，包括IL-6、TNF-α、IL-1β和干扰素-α（IFN-α）。此外，与心肌炎相关的干扰素-γ（IFN-γ）和C-X-C基序趋化因子配体10（CXCL10）以及心肌损伤生物标志物心肌肌钙蛋白I（cTnI）在负电荷LNP中也显著降低。在局部反应原性方面，所有LNP配方均显著增加了注射肌肉的血管通透性，负电荷LNP的局部反应原性与常规LNP相当。值得注意的是，含油酰链磷脂的LNP（DOPC-LNP、DOPA-LNP和DOPS-LNP）比含硬脂酰链磷脂的LNP（DSPC-LNP、DSPA-LNP和DSPS-LNP）诱导了更高的局部炎症反应。
研究人员还评估了DSPS在降低PEG脂质比例配方中的作用。将PEG脂质从1.5%降至0.5%会加剧DSPC配方的全身反应原性，而DSPS的掺入无论PEG比例如何均显著降低了发热和全身炎性细胞因子产生，并改善了储存稳定性。在肝脏炎症反应方面，DSPC-LNP增加了肝脏中促炎细胞因子和趋化因子的产生，而负电荷LNP减弱了这些应答。细胞摄取分析显示，负电荷LNP减少了肝细胞、单核细胞和肝窦内皮细胞对LNP的摄取。相关分析表明，肝脏蛋白表达和LNP分布与发热显著正相关，而肌肉LNP分布与发热显著负相关。在排除PEG修饰配方的合并分析中，仅肝脏蛋白表达与发热呈显著正相关。
三、关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：基于微流控技术（NanoAssemblr Ignite）制备LNP；动态光散射（DLS）表征粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位；RiboGreen RNA定量法评估mRNA包封效率；体外细胞转染实验（HEK293和DC2.4细胞系）；小鼠肌肉注射模型评估体内荧光素酶表达和组织分布；DiD荧光标记LNP追踪生物分布；酶联免疫吸附测定（ELISA）定量抗原特异性IgG；基于活病毒的SARS-CoV-2中和抗体测定；主要组织相容性复合体（MHC）I类四聚体染色结合流式细胞术检测S特异性CD8+ T细胞；细胞内细胞因子染色结合流式细胞术分析脾细胞中抗原特异性T细胞应答；血凝抑制（HI）试验评估流感疫苗功能抗体；Nanotag?遥测系统连续记录体温和自发行为；多重微球免疫分析（LEGENDplex）定量血浆和组织中的细胞因子/趋化因子；ELISA检测血浆心肌肌钙蛋白I（cTnI）；伊文思蓝染料（EBD）外渗实验评估肌肉血管通透性；流式细胞术分析肝脏、肌肉等组织的免疫细胞浸润和LNP细胞摄取。动物实验使用6至8周龄雌性C57BL/6J和BALB/c小鼠。
四、研究结果
3.1 负电荷LNP的理化表征和生物分布：通过用阴离子磷脂（DSPA、DSPS、DOPA、DOPS）替换中性磷脂DSPC，成功制备了具有负Zeta电位的LNP。含阴离子磷脂的LNP（DSPA-LNP和DOPA-LNP）mRNA包封效率显著降低（约70%），而DSPS-LNP和DOPS-LNP保持约90%的包封效率。体外转染中负电荷LNP蛋白表达降低，但体内肌肉注射后各配方在注射肌肉中的蛋白表达相当。负电荷LNP显著降低了肝脏递送和肝脏蛋白表达。
3.2 负电荷LNP诱导与常规LNP相当的免疫应答：在C57BL/6J和BALB/c小鼠中，所有LNP配方诱导的S特异性IgG抗体水平相当，S特异性CD8+ T细胞应答也相当。在流感HA mRNA疫苗中，DSPS-LNP诱导的HA特异性IgG和HI滴度与DSPC-LNP相当。负电荷LNP在不同病毒抗原和小鼠品系中均保持了与常规LNP相当的免疫原性。
3.3 负电荷LNP降低全身炎性细胞因子产生和发热：常规DSPC-LNP在初次和加强免疫后均诱导显著发热，而负电荷LNP显著抑制了发热。DSPC-LNP诱导了血浆中大多数检测细胞因子的显著升高，负电荷LNP显著减弱了这些应答，包括IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-α。与心肌炎相关的IFN-γ和CXCL10以及cTnI在负电荷LNP中也显著降低。
3.4 负电荷LNP诱导与常规配方相当的局部反应原性：所有LNP配方均显著增加了注射肌肉的血管通透性。含油酰链磷脂的LNP比含硬脂酰链磷脂的LNP诱导了更高的局部细胞因子产生和免疫细胞浸润。DSPS-LNP的局部反应原性与DSPC-LNP相当。
3.5 负电荷LNP抑制PEG减少LNP诱导的炎症应答：将PEG脂质从1.5%降至0.5%加剧了DSPC配方的全身反应原性，而DSPS的掺入无论PEG比例如何均显著降低了发热、全身炎性细胞因子产生和cTnI水平，并改善了储存稳定性。
3.6 负电荷LNP减弱肝脏炎症特征：DSPC-LNP增加了肝脏中促炎细胞因子和趋化因子的产生，负电荷LNP减弱了这些应答。负电荷LNP减少了肝细胞、单核细胞和肝窦内皮细胞对LNP的摄取，并减少了肝脏免疫细胞浸润。
3.7 LNP生物分布与mRNA疫苗接种后发热相关：肝脏蛋白表达和LNP分布与发热显著正相关，肌肉LNP分布与发热显著负相关。在排除PEG修饰配方的合并分析中，仅肝脏蛋白表达与发热呈显著正相关。血浆中部分促炎细胞因子（如IL-6和IFN-γ）与脾脏和肝脏中的蛋白表达显著相关。
五、讨论与结论
讨论部分指出，负电荷LNP在体外转染效率显著低于中性LNP，而体内注射肌肉中的蛋白表达相当。体外负电荷LNP可能因排斥带负电的细胞表面而降低细胞摄取，而体内肌肉注射后组织局部压力增加可能有助于LNP进入细胞。经肌肉注射的mRNA疫苗中有一部分可进入全身循环并到达远端器官，负电荷LNP经肌肉注射后肝脏分布降低并减少了肝脏炎症应答，这可能与LNP表面形成的蛋白冠差异有关。
研究结论为：阴离子磷脂可实现负电荷LNP的工程化；负电荷LNP降低了炎症、发热和心肌肌钙蛋白I水平；尽管反应原性降低，抗原特异性免疫原性得以维持；反应原性降低与肝脏LNP递送减少相关；表面电荷控制可在保持免疫原性的同时降低反应原性。该研究发表在《Journal of Controlled Release》期刊上。
