基于噻唑橙（TO）与二苯并噻唑（DB）的荧光DNA构建块合成及其准分子与能量转移读出

《ChemPlusChem》：Synthesis of DNA Building Blocks With Thiazole Fluorophores for Fluorescent Readout by Excimers and Energy Transfer

　　

两种新的带电荷DNA构建块以噻唑橙（thiazole orange, TO）和二苯并噻唑（dibenzothiazole, DB）作为荧光DNA碱基替代物（fluorescent DNA base surrogates）合成。由于以荧光团对（fluorophore pairs）形式掺入寡核苷酸（oligonucleotides），使其在杂交（hybridization）时以链间（interstrand）和链内（intrastrand）取向相互作用，因而促进DNA结构内的准分子（excimer）形成和能量转移（energy transfer）。准分子形成和能量转移不仅导致荧光强度变化，而且导致显著红移（redshifted）发射。此外，DB被研究作为能量供体（energy donor），以TO以及氰基乙烯类（cyanovinylenes）和氨基萘酰亚胺类（aminonaphthalimides）作为DNA中的能量受体（energy acceptors）。这些组合使DB成为用于DNA检测和成像（imaging）的多功能荧光团（fluorophore）。此类灵敏荧光探针（fluorescent probes）基本上能够不仅通过荧光强度变化而且通过发射颜色（emission color）读出实现核酸（nucleic acids）的序列特异性（sequence-specific）检测。

研究背景：荧光核酸是分子诊断、生物分析传感和活细胞成像的重要工具。DNA或RNA的序列特异性检测通常依赖杂交敏感探针，其发射性质随局部环境变化而响应。现有探针多基于荧光强度调制，但发射峰的光谱位移读出更稳健，因为其较少受非特异性结合或探针浓度波动产生的伪影影响。相邻生色团嵌入DNA后可形成激发态复合物，从而实现显著发射位移；其中两个相同荧光团形成准分子（excimer），表现为无明显精细结构的明显红移发射，而两个不同染料相互作用形成激基复合物（exciplex）。此外，多生色团DNA结构已被广泛用于介导F?rster共振能量转移（F?rster resonance energy transfer, FRET），用于检测错配、突变或DNA构象修饰等结构特征。经典准分子染料芘（pyrene）虽已被成功整合入DNA，但其紫外激发可能诱导DNA损伤，且对氧敏感；苝二酰亚胺（perylene bisimides）虽可在双链DNA中形成红移发射的准分子，但易被鸟嘌呤通过光诱导电子转移猝灭。TO可在450 nm以上可见光激发，且氧化还原电位可避免鸟嘌呤氧化，已成为核酸检测标准荧光团之一；已有多种结构策略将TO以杂交敏感方式引入核酸。基于此，研究人员设计并合成了两种新型噻唑类荧光DNA构建块TO和DB：TO作为准分子形成基准生色团，DB由K21结构衍生并设计用于共价掺入DNA骨架，以便在确定DNA结构中精确控制位置。该设计可在互补DNA单链中放置两个染料以实现链间取向准分子形成，也可在单一寡核苷酸中相邻放置两个染料以实现链内取向准分子形成。DB还可作为DNA双链中的有效能量供体，扩展基于准分子的读出概念。研究目的是探索其敏化TO以及氰基乙烯类（cyanovinylenes）和氨基萘酰亚胺类（aminonaphthalimides）等受体的能力，展示准分子形成和能量转移如何用于构建具有荧光读出的DNA结构。重要意义在于，此类读出通过荧光强度和发射颜色提供核酸序列特异性检测的敏感荧光探针，并扩展DNA基荧光探针工具箱，用于核酸检测和成像。

关键技术方法概述：研究人员采用自动固相DNA合成（automated solid-phase DNA synthesis）将TO与DB的亚磷酰胺（phosphoramidite）构建块共价掺入寡核苷酸；通过退火构建链间与链内荧光团二聚体及DB-受体反平行双链；主要表征包括紫外/可见吸收光谱（UV/Vis absorption）、荧光发射光谱、荧光量子产率（Φ_F）、熔解温度（T_m）、荧光寿命及能量转移效率计算。原文未涉及样本队列来源。

研究结果：
2.1 TO与DB DNA构建块的合成（Synthesis of TO and DB DNA Building Blocks）。研究人员以(S)-3-氨基-1,2-丙二醇作为非环连接臂，将TO通过喹啉部分而非苯并噻唑部分连接，合成亚磷酰胺7；该构建块为既往TO衍生物的区域异构体，设计用于提供不同的DNA中TO取向。DB采用相同非环连接臂，经2-甲基苯并噻唑亲核取代、碱催化缩合、CDI活化、与含DMT保护基的连接臂5形成氨基甲酸酯，最终制得亚磷酰胺11。由此获得可共价掺入寡核苷酸的TO和DB荧光DNA构建块。

2.2 DNA中TO荧光二聚体（Fluorescent Dimers of TO in DNA）。通过比较单修饰TO-DNA1ss、双链TO-DNA1、链间二聚体TO-DNA2及链内二聚体TO-DNA3的吸收、发射、Φ_F和T_m，研究人员发现TO-DNA2吸收精细结构反转，发射峰红移至575 nm并失去TO特征精细结构，Φ_F为0.044，低于TO-DNA1的0.077；TO-DNA1发射553 nm。TO-DNA2与TO-DNA1的T_m相近（66.9与66.2 °C），提示二聚体生色团相互作用稳定双链。肉眼观察TO-DNA1发绿光而TO-DNA2发橙光。TO-DNA3链内二聚体吸收为462/495 nm，发射565 nm，Φ_F为0.021，杂交不影响其吸收和染料-染料相互作用，说明单链架构足以诱导二聚和红移发射；链内平行排列促进额外非辐射途径，可能由H聚集导致更有效荧光猝灭。结论是TO构建块可形成静态链间和链内准分子，但以喹啉连接的非环连接臂未改善荧光读出，连接位点对生色团取向和二聚体几何至关重要。

2.3 DNA中DB荧光二聚体（Fluorescent Dimers of DB in DNA）。通过比较DB-DNA1ss、DB-DNA1、DB-DNA2和DB-DNA3，研究人员发现DB-DNA1ss与DB-DNA1吸收峰为430 nm并带407 nm肩峰，单修饰时双链形成不显著影响吸收；杂交使DB荧光强度显著增加，Φ_F由33.3%升至66.5%，发射峰由466 nm移至460 nm。DB-DNA2中两个DB反平行放置后吸收精细结构反转（407 nm为主，430 nm为肩），发射红移至472 nm，相对DB-DNA1红移12 nm，Φ_F降至30.0%，T_m略高（68.0与66.0 °C），支持静态DB准分子形成。DB-DNA3链内二聚体吸收与DB-DNA2类似，DB-DNA3ss发射487 nm、DB-DNA3发射480 nm，均较单修饰红移且比链间二聚体更红；Φ_F分别为15.3%和22.1%，提示平行排列促进非辐射衰变和荧光猝灭。结论是DB重现TO的几何依赖聚集特征，同时提供不同发射窗口和供体功能。

2.4 DNA中DB混合荧光二聚体（DB-Mixed Fluorescent Dimers in DNA）。DB在双链DNA中于460 nm发射，与TO（λ_abs=490 nm）、CV1（λ_abs=500 nm）、CV2（λ_abs=515 nm）、AN1和AN2（λ_abs=453 nm）的吸收重叠。研究人员将DB-DNA1cs与X修饰互补链退火形成X-DNA4（X=TO、CV1、CV2、AN1、AN2），在400 nm主要或选择性激发DB。受体单修饰单链及相应双链在400 nm激发时仅见弱荧光，而X-DNA4出现DB供体发射（465 nm）和增强的受体发射：TO为532 nm、CV1为552 nm、CV2为563 nm，AN1和AN2为重叠受体发射带，证明能量转移。能量转移效率为80%–97%，最高为CV1（97%），其次CV2（93%）、TO（92%），AN1和AN2分别为83%和80%；这些双链Φ_F为0.151–0.361。结论是DB可作为多功能供体，在双链限定几何中敏化选定受体，使荧光读出超越准分子发射；CV1和CV2因供受体发射范围分离好、Φ_F较高（22%和26%）、能量转移效率高（97%和93%）及荧光寿命（τ₂=8.15和5.55 ns）适合荧光成像。

讨论与结论：讨论部分指出，TO和DB二聚体在DNA中的光学光谱性质表明噻唑衍生荧光团作为核酸敏感染料具有多功能性；TO构建块可产生静态链间和链内准分子荧光读出，DB构建块则通过静态准分子形成和能量转移供体功能扩展读出。DB可与TO、CV1、CV2、AN1和AN2等选定受体染料发生有效能量转移。准分子发射和基于能量转移的荧光读出显著扩展DNA基荧光探针工具箱，并为核酸高级荧光检测和成像提供通用平台。研究结论翻译：总之，研究人员开发了两种新型合成荧光DNA构建块，即TO和DB，作为噻唑衍生荧光团，其在二聚体形式中可在相应DNA结构的链间和链内取向实现激发态相互作用。新的TO核苷酸类似物提供静态链间和链内准分子形成，作为DNA中的荧光读出。基于该结构概念，DB核苷酸类似物通过静态准分子形成和能量转移供体扩展荧光读出。DB与选定受体染料包括TO、CV1、CV2、AN1和AN2发生有效能量转移。准分子发射和基于能量转移的荧光读出显著扩展DNA基荧光探针工具箱，并为核酸高级荧光检测和成像提供通用平台。TO、DB和混合DB二聚体在DNA中的光学光谱性质强调噻唑衍生荧光团作为核酸敏感染料的多功能性，从而以开启（turn-on）和红移（redshift）作为荧光读出扩展可用核酸荧光探针工具箱。