基于活性蛋白质组学的去泛素化酶抑制剂发现及其免疫调节活性

《npj Drug Discovery》：Activity-based proteomics discovery of deubiquitinating enzyme inhibitors with immunomodulatory activity

去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）在人类病理过程中发挥关键作用，包括癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。强效且选择性的靶向活性位点DUB抑制剂进入临床试验，证明了这类分子的治疗潜力；然而，DUB家族成员间共享的催化几何结构对实现抑制剂选择性构成了挑战。研究人员描述了一种高通量、聚焦DUB的基于活性的蛋白质组学工作流程，用于鉴定新型半胱氨酸反应性DUB抑制剂。研究人员证明了αβ,α′β′-二环氧酮（diepoxyketones，DEKs）和泛素衍生共价反应炔烃作为首个选择性、细胞活性化合物靶向USP47、OTUD7B（Cezanne）和USP5的潜力。这些DUB被报道在炎症小体形成、缺氧和病毒复制中分别发挥关键作用。所鉴定的化合物重现了这些发现，证明了这些DUB作为免疫治疗靶点的可处理性。

研究背景与科学问题

去泛素化酶（deubiquitinases，DUBs）是一类主要通过切割底物蛋白上的泛素（ubiquitin，Ub）修饰来调控蛋白质命运的半胱氨酸酶，在蛋白质稳态、细胞信号传导等关键生命过程中发挥核心作用。DUB功能失调与癌症、神经退行性疾病、炎症、感染及免疫介导疾病密切相关。尽管靶向活性位点的USP1、USP28和USP30等DUB抑制剂已进入针对实体瘤、急性髓系白血病、慢性肾病和帕金森病的临床试验，但由于DUB家族成员共享高度保守的催化几何结构，开发高选择性的活性位点导向抑制剂仍是重大挑战。传统的高通量筛选（high-throughput screening，HTS）成本高、命中率低，且依赖重组蛋白，难以全面反映天然细胞环境中的调控状态。为此，研究人员旨在建立一种更高效、灵活且易于推广的基于活性的蛋白质组学平台，用于快速发现新型选择性DUB抑制剂。

研究方法与技术路线

研究人员改进并建立了名为ABPP-HT*的高通量活性蛋白质组学工作流程。该流程的核心技术包括：使用血凝素标记的泛素-炔丙基酰胺（HA-Ub-PA）作为活性探针（activity-based probe，ABP），其炔基弹头可与DUB活性位点半胱氨酸发生不可逆共价反应；采用96孔板磁珠免疫沉淀结合自动化或台式纯化系统进行样品处理；利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合数据非依赖性采集（data-independent acquisition，DIA）模式进行深度DUB组（DUBome）分析。此外，研究人员还运用了分子对接模拟、氢氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry，HDX-MS）、重组酶活性测定以及SARS-CoV-2病毒感染模型等功能验证手段。

主要研究结果

1. 基于ABPP-HT的化合物筛选与命中鉴定*

研究人员将ABPP-HT*平台应用于一个包含41种非常规半胱氨酸反应性化合物的库的筛选，涵盖四类分子：αβ,α′β′-二环氧酮（DEKs）、电子活化γ-内酰胺、迈克尔受体以及泛素衍生肽类抑制剂。在MCF-7乳腺癌细胞裂解液中，该平台稳健地富集了38种DUB。筛选发现8种化合物可将至少一种DUB的探针标记降低超过20%，其中化合物3选择性抑制USP47和USP7，化合物6选择性抑制OTUD7B，化合物25高度选择性抑制USP5。

2. 命中验证与剂量效应分析

通过免疫印迹和浓度梯度实验，研究人员验证了上述三个化合物的靶标特异性。化合物3对USP47的IC₅₀约为8.8 μM，优于其对USP7的约36 μM，显示出优先抑制USP47的特性。化合物6对OTUD7B具有选择性，而化合物25在整个测试浓度范围内仅抑制USP5。竞争实验表明这三种化合物均以不可逆方式结合于DUB活性位点。

3. 化合物3选择性抑制USP47的分子机制

重组酶活性测定显示，化合物3在预孵育30分钟后对USP47的抑制效力（IC₅₀约0.48 μM）比USP7（约4.3 μM）高出约10倍。分子对接研究表明，化合物3通过与催化半胱氨酸C197形成共价加合物并结合于拇指-手掌裂隙。关键区别在于，USP47中的R402可与化合物3形成氢键，而USP7对应位置的N418侧链较短无法形成此相互作用。HDX-MS分析进一步揭示，化合物3的结合诱导USP47发生开关环重排并可能招募激活肽，而在USP7中未观察到类似的远端构象变化，从而解释了其选择性。

4. 抑制USP47对炎症小体活化的影响

在PMA分化的THP-1人单核细胞中，化合物3处理可抑制NLRP3炎症小体的激活，表现为Caspase-1活性降低、ASC寡聚化受阻、Caspase-1和gasdermin D（GSDMD）的剪切减少。同时，化合物3处理后NLRP3出现高分子量弥散条带，提示其泛素化水平升高。较低浓度的化合物3在延长尼日霉素处理后提高了细胞存活率，表明其减少了炎症小体介导的焦亡。

5. 抑制OTUD7B对缺氧信号及SARS-CoV-2复制的影响

重组OTUD7B催化域实验证实化合物6的IC₅₀约为1.9 μM，完整蛋白质谱确认了共价修饰。在Calu-3细胞中，化合物6在缺氧条件下剂量依赖性地降低HIF-1α蛋白水平，这一效应依赖于功能性VHL。在HAP1 OTUD7B敲除细胞中，HIF-1α本底水平已显著降低，且化合物6不再产生额外效果，支持其靶上机制。在SARS-CoV-2感染模型中，缺氧条件本身可抑制病毒复制，而化合物6处理显著削弱了这一抗病毒效应。

6. 抑制USP5的抗病毒作用与机制

化合物25及其优化衍生物25a和25b在裂解液中对USP5保持高度选择性，不交叉反应USP18等其他去ISG化酶。细胞渗透性优化后的化合物25b在HAP1细胞中可增强Poly I:C诱导的I型干扰素（IFN-I）产生。在SARS-CoV-2感染实验中，化合物25b剂量依赖性地抑制病毒复制，其IC₅₀约为瑞德西韦的十分之一，且在高达200 μM浓度下未见明显细胞毒性。此外，化合物25b对甲型流感病毒和脑心肌炎病毒也表现出抗病毒活性。

总结与讨论

本研究成功将ABPP-HT*平台发展为一个广泛适用且可扩展的工作流程，兼具灵敏度、灵活性和易用性。通过对一个包含非常规半胱氨酸反应性化学型的文库进行筛选，命中率较传统DUB HTS提高了约10倍。研究人员发现了首个选择性靶向USP47的DEK类化合物3、首个选择性靶向OTUD7B的DEK类化合物6，以及基于泛素衍生炔烃的高度选择性USP5抑制剂化合物25及其细胞渗透性衍生物。这些工具化合物在功能实验中重现了基因敲除的表型：化合物3抑制NLRP3炎症小体活化，化合物6通过下调HIF-1α减弱缺氧对SARS-CoV-2复制的抑制作用，化合物25b通过增强IFN-I信号通路展现广谱抗病毒活性。这些结果证明了USP47、OTUD7B和USP5作为免疫治疗靶点的可药性，并为DUB抑制剂发现提供了高效的新策略。