招募E3连接酶支架蛋白MAGEA11的组织选择性PROTAC设计

《npj Drug Discovery》：Design of Tissue-Selective PROTACs Through Recruiting E3 Ligase Scaffolding Protein MAGEA11

　　

蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）是一种新兴的治疗模式，通过招募E3连接酶诱导蛋白质降解。大多数已报道的PROTAC招募广泛表达的E3连接酶，如cereblon和希佩尔-林道肿瘤抑制因子（VHL）。在另外600多种E3连接酶中，招募那些具有组织限制性表达的E3连接酶对于提高PROTAC的特异性具有吸引力。本研究首次报道了一种招募组织特异性E3连接酶支架蛋白MAGEA11的PROTAC。作为初步验证，研究人员合成了招募MAGEA11的靶向溴结构域和额外末端结构域（BET）的PROTAC，并在骨肉瘤U2OS细胞中进行筛选，确定了先导化合物105B。105B在U2OS细胞（BRD4 DC₅₀ = 0.130 nM，Dmax = 78%）和KYSE180食管鳞状细胞癌细胞系（DC₅₀ = 40 nM，Dmax = 70%）中降解BET蛋白，但在非癌性HEK293T细胞中无降解。机制研究证实105B的活性依赖于泛素-蛋白酶体系统以及MAGEA11和HUWE1的表达。105B降低了BET调控的基因产物RUNX2和KRT14的水平；然而，要实现选择性细胞毒性仍需进一步改进。本工作首次报道了招募组织特异性E3连接酶以实现BET蛋白癌症限制性降解的PROTAC，并强调了进一步开发MAGEA11招募型降解剂的必要性。

蛋白降解靶向嵌合体（PROTACs）通过双功能分子同时结合靶蛋白和E3连接酶，诱导泛素-蛋白酶体系统介导的靶蛋白降解。大多数PROTAC依赖广泛表达的cereblon或VHL等E3连接酶，这可能导致在健康组织中的脱靶毒性。招募组织特异性或癌症特异性表达的E3连接酶是提高PROTAC选择性的重要策略，但此前尚无PROTAC成功招募癌症特异性E3连接酶支架蛋白。MAGEA11是黑色素瘤抗原基因（MAGE）家族成员，属于癌症-睾丸抗原，在正常组织中仅表达于精子与胎盘，在骨肉瘤、食管鳞状细胞癌（ESCC）等多种癌症中异常表达。MAGEA11可与E3连接酶HUWE1结合介导底物泛素化。研究人员据此提出，招募MAGEA11可实现癌症限制性的靶蛋白降解。

研究人员基于已知的MAGEA11配体SJ1008066和BET配体(+)-JQ1，设计并合成了14个连接子长度和组成不同的PROTAC分子，在骨肉瘤U2OS细胞中筛选获得先导化合物105B。105B在U2OS和KYSE180细胞中有效降解BET蛋白，在非癌性HEK293T细胞中无降解。机制研究表明其作用依赖泛素-蛋白酶体系统及MAGEA11和HUWE1。这是首个招募组织特异性E3连接酶支架蛋白的PROTAC，证明通过招募癌症特异性E3连接酶实现组织选择性降解的可行性，为PROTAC选择性设计提供了新方向。

主要技术方法包括：基于已知配体设计并化学合成14种不同连接子（PEG或烷基，长度3-28原子）的PROTAC库；在骨肉瘤U2OS细胞中进行24小时、4点浓度初筛，通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测BRD4水平；利用荧光偏振竞争性结合实验测定化合物与BRD4-BD1的结合亲和力（Ki）；在U2OS、KYSE180及非癌性HEK293T细胞中进行完整剂量-反应实验；采用小干扰RNA（siRNA）敲低HUWE1和MAGEA11；使用MG132（蛋白酶体抑制剂）和MLN4924（NEDDylation抑制剂）验证泛素-蛋白酶体依赖性；通过CellTiter-Glo定量细胞活力。

**招募MAGEA11的PROTAC设计与先导105B的鉴定**：研究人员设计合成了14个PROTAC，在U2OS细胞中筛选，确定了105B为可选先导。105B与BRD4-BD1结合的Ki为14.9 ± 0.97 nM，较(+)-JQ1和MZ-1约高2倍，表明连接子修饰对结合影响较小。105B在U2OS细胞中降解BRD4的DC₅₀为130 ± 30 pM，Dmax为78 ± 2%，在约41 nM以上出现hook效应；在KYSE180细胞中DC₅₀为40 ± 11 nM，Dmax为70 ± 3%，在10 μM内无明显hook效应；在HEK293T细胞中任何浓度均未观察到BRD4降解。

**105B依赖泛素-蛋白酶体系统以及MAGEA11和BRD4的结合**：时间进程实验显示105B（10 nM）在4小时内引起BRD4降解，24小时时部分回升。在MG132或MLN4924存在下，BRD4水平恢复至对照水平，表明依赖26S蛋白酶体和NEDD8激活的E3连接酶。HUWE1敲低完全抑制105B的活性，确认HUWE1是介导降解的E3连接酶。竞争实验显示过量(+)-JQ1可完全恢复BRD4水平，而过量SJ1008066可部分抑制降解。在MAGEA11敲低细胞中，105B未进一步降低BRD4水平，表明其活性依赖MAGEA11表达。

**105B降解所有BET家族蛋白并降低U2OS和KYSE180细胞中致癌蛋白水平**：105B在U2OS细胞中同样降解BRD2和BRD3（BRDT不表达），降解浓度范围与BRD4一致，且BRD2降解无显著hook效应。在U2OS细胞中，105B在100 nM和1 μM浓度下使c-Myc降低超过80%，但(+)-JQ1和MZ-1对c-Myc无显著影响；105B使RUNX2水平降低约50%，而(+)-JQ1和MZ-1分别降低约70%和90%。用MAGEA11抑制剂SJ1008066处理U2OS细胞同样降低c-Myc和BRD4，但不影响RUNX2，提示MAGEA11信号与c-Myc调节有关。在KYSE180细胞中，105B不降解BRDT，但以剂量依赖性方式降低KRT14水平，峰值降低50-60%。细胞活力方面，105B在U2OS细胞中72小时未显著影响活力；在KYSE180中仅在10 μM时降低30%活力，但在HEK293T中也有类似降低，提示为脱靶效应。

讨论部分指出，本研究首次报道了招募MAGEA11的PROTAC。105B在U2OS中的DC₅₀与最强效的BRD4降解剂QCA570和ARV-825相当，但无法完全降解BRD4，且存在有效浓度窗口较窄的问题。降解动力学与cereblon招募型降解剂dBET6类似，在4-8小时降解，8-24小时开始反弹。研究人员发现MAGEA11抑制或敲低会降低BRD4和c-Myc水平，可能与MAGEA11稳定E2F1从而上调c-Myc有关，这可能是105B下调c-Myc的额外机制。105B虽降低致癌蛋白水平，但未显著抑制细胞活力，可能归因于BET蛋白未被完全降解，有待通过优化连接子等进一步提高药效。

研究结论为：本文详细报道了首个招募癌症特异性E3连接酶支架蛋白MAGEA11的PROTAC的合成与评估。研究人员设计合成了14个PROTAC并鉴定出先导分子105B。105B在U2OS细胞中以亚纳摩尔浓度、在KYSE180细胞中以纳摩尔浓度降解BET蛋白BRD4、BRD3和BRD2，但在MAGEA11阴性的HEK293T细胞中不降解BRD4。机制研究证实105B的作用具有时间和泛素-蛋白酶体依赖性。105B降低致癌蛋白c-Myc、RUNX2和KRT14的水平，但对细胞活力无影响。这一首个MAGEA11招募型PROTAC拓展了可用于靶向蛋白降解的E3连接酶相关蛋白工具箱，并为后续优化设计提高疗效奠定了基础。