时空分辨单核转录组学揭示帕金森病中脑黑质的细胞与区域易感性

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Spatiotemporally resolved single-nucleus transcriptomics reveals cellular and regional vulnerability in the midbrain in Parkinson’s disease

　　

摘要专业翻译 帕金森病（Parkinson's disease, PD）在临床和生物学上具有异质性，种族差异可能影响其发病机制。然而，来自东亚人群的单核转录组数据仍然有限。本研究呈现了一个跨越PD连续谱系——包括对照（control）、偶发性路易小体病（incidental Lewy body disease, iLBD）和晚期PD——的人脑黑质（substantia nigra, SN）空间分辨单核转录组图谱，研究对象为经病理确诊的韩国个体。整合分析揭示了α-突触核蛋白（α-synuclein, α-Syn）在黑质腹外侧的早期聚集、多巴胺能神经元的亚型选择性易感性，以及黑质背内侧和腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）的相对保留。星形胶质细胞和小胶质细胞的轨迹及基因调控网络分析揭示了时空上截然不同的、疾病相关的胶质细胞反应，每种反应均由不同的分子程序驱动。研究还鉴定了两个转录上不同的血管空间簇，它们表现出差异性的易感性和重塑。对α-Syn阳性区域的空间配体-受体分析揭示了与早期病理相关的细胞间信号事件，包括细胞外基质重塑和突触黏附，这些事件在iLBD中显著，但在晚期PD中大幅减弱。利用MAGMA与PD全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）的整合分析表明，遗传风险、空间分辨的细胞状态程序和伪时间推断的小胶质细胞动力学在不同祖先人群之间存在差异耦合。本研究提供了首个来自东亚PD队列的高分辨率、空间映射单核转录组资源，阐明了中脑细胞间和微环境中的早期扰动，这些扰动可能构成选择性多巴胺能易感性的基础，并为制定祖先信息指导的治疗策略提供参考。

论文解读文章

一、研究背景与意义

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是第二大常见的神经退行性疾病，以α-突触核蛋白（α-synuclein, α-Syn）异常聚集导致路易小体形成以及中脑黑质（substantia nigra, SN）多巴胺能神经元进行性丢失为特征。由于临床症状通常在多巴胺能神经元大量丢失后才显现，PD的早期检测面临巨大挑战。神经病理学研究表明，PD中神经元的易感性并非在黑质内均匀分布，而是遵循空间选择性模式，提示局部细胞环境和区域分子程序可能影响疾病易感性。遗传学研究虽已鉴定出SNCA、LRRK2、GBA1和PARK2等PD相关风险基因，但PD相关变异的频率和等位基因分布在不同种族人群中存在差异，反映了群体遗传背景的不同。尽管近期GWAS研究已扩展至亚洲和非洲人群，但来自非欧洲人群的转录组资源仍然有限。现有的大多数单细胞或单核转录组数据集基于解离的细胞核，缺乏空间背景信息，且主要来自欧洲血统个体，这限制了对PD中群体特异性分子机制的理解。因此，构建包含东亚人群、具有空间分辨率的PD中脑转录组图谱，对于阐明遗传风险如何在细胞水平上体现以及疾病进展过程中细胞易感性如何变化至关重要。

二、主要技术方法

研究人员利用8例尸检供体（4例对照，4例PD）的黑质组织，通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离细胞核，采用10x Chromium平台进行单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）。同时，在6个组织切片（1例对照、2例iLBD、3例PD）上使用Visium平台进行空间转录组分析，并以α-Syn和神经元标志物的免疫荧光成像为指导，结合酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）、钙网蛋白、钙结合蛋白、苏木精-伊红（H&E）和Luxol Fast Blue（LFB）染色进行区域验证。此外，研究还整合了PD全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）数据，利用MAGMA工具进行基因集富集分析，比较东亚（East Asian, EAS）和欧洲（European, EUR）人群的遗传风险关联。

三、研究结果

1. 黑质中的主要细胞类型和PD相关空间改变

snRNA-seq无监督聚类揭示了8种主要细胞类型，对照和PD样本的细胞在各簇中广泛混合。空间转录组聚类鉴定出15个空间簇（SC0–SC14）。SC10（SLC6A3高表达多巴胺能神经元）在PD患者中显著减少，反映多巴胺能神经元丢失；SC5呈现类似但较不明显的模式。SC7在PD患者中扩展至原外侧黑质区域，可能反映该区域大量神经元丢失导致的结构破坏。血管簇中，SC6在PD中减少，而SC8保持稳定。伪批量差异表达分析显示，黑质相关SC2、SC10和SC11以及血管SC6和SC8中差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）数量最多。

2. PD黑质中的神经元异质性和易感多巴胺能亚型

神经元亚聚类分析鉴定出11个转录上不同的亚簇（NC1–NC11），其中NC3和NC8为多巴胺能，NC7和NC9–NC11为GABA能，NC1、NC2和NC6为谷氨酸能。与对照相比，PD患者多巴胺能和谷氨酸能神经元减少，尤其是NC3，而大多数GABA能群体相对增加。与Kamath等人数据集的整合分析证实NC3和NC8对应SOX6阳性多巴胺能神经元。空间去卷积显示，在SC10中，NC3丰度显著降低，而NC8在iLBD中增加，提示早期易感性和代偿性募集。NC3以THY1、RAB3A和TH高表达为特征，与Kamath等人的SOX6_AGTR1亚型高度重叠；NC8富集TTC6、KLHL1和SEMA6D，并上调神经保护基因UNC5D和OXR1。转录调控子活性分析清楚地区分了NC3和NC8，证实转录相似性构成选择性易感性的基础。RNAscope验证显示，PD中SLC18A2阳性神经元显著减少，信号仅保留在背内侧区域（对应VTA），而GAD2阳性GABA能神经元仍广泛分布。

3. PD进展中的早期血管应激和亚型特异性变化

研究人员分析了两个转录上不同的血管空间簇SC6和SC8。SC8富集典型平滑肌标志物MYH11和ACTA2，提示动脉壁细胞丰富；SC6高表达ACKR1（毛细血管后微静脉标志物）以及TIMP1、TNFRSF6B、S100A8和S100A9等血脑屏障完整性和内皮应激相关基因。在iLBD中，两个簇在黑质中的丰度均高于大脑脚（cerebral peduncle, CP），提示早期区域特异性血管重塑。SC6在iLBD中瞬时上调S100A9和CCL19表达，表明早期免疫激活；而CD163、VSIG4和BST2等抗炎和稳态巨噬细胞样程序标志物在PD中广泛减少，提示血管免疫静默的丧失。晚期进展中EGR1、NR4A1、FAM118A和TAF11L6的稳健上调表明慢性内皮应激和血管退行性变。

4. PD中轨迹定义的星形胶质细胞状态和空间重组

Monocle伪时间轨迹分析鉴定出8个星形胶质细胞组分（AC1–AC8），其中AC6（轨迹1，T1）和AC8（轨迹2，T2）为PD富集的轨迹终点，均从AC3分支。RNA速度分析证实从AC3向AC6和AC8的矢量流，AC3富集脂肪酸氧化、组蛋白代谢和PPAR介导信号等稳态功能相关GO条目。T1特异性上调基因与受体激酶信号通路、GDNF受体信号和生长抑制信号程序相关；T2基因富集ECM组织、IGFBP介导的IGF信号调节和细胞因子反应等损伤相关重塑程序。TENET基因调控网络分析鉴定出4个调控模块，模块3与氧化应激和线粒体自噬调节相关。空间去卷积显示，AC6富集于黑质相关簇（SC2、SC10、SC11），而AC8在大脑脚簇（SC12、SC13）中逐渐显著。RNAscope验证显示，iLBD中黑质星形胶质细胞CHI3L1转录本增加，而PD中CHI3L1阳性星形胶质细胞CD44表达显著增加，提示向慢性反应状态的转变。

5. PD中小胶质细胞转变的空间和时间区分

小胶质细胞轨迹分析鉴定出5个转录组分（MC1–MC5）。MC1为基线调节状态，MC2富集蛋白质代谢和核糖体生物发生，MC5从MC2分支并富集抗原呈递、内质网应激反应和吞噬作用，MC4从MC1分支并显示代谢重编程。轨迹结构包含从MC1到MC4（T1）和从MC2到MC5（T2）两个主要分支。T1特异性上调基因富集抗原呈递和髓系样激活等免疫相关过程，在轨迹中段达到峰值；T2 DEGs富集内质网蛋白加工、吞噬作用以及细胞因子和免疫信号通路，沿轨迹逐渐持续增加。空间去卷积显示，MC1和MC4主要富集于大脑脚区域（SC12），MC2和MC5主要定位于黑质相关簇（SC2、SC10、SC11），而MC3在血管簇（SC6和SC8）中富集。在iLBD中，小胶质细胞丰度在SC12、SC2和血管簇中增加，但在黑质神经元簇（SC10和SC11）中减少。MC3在iLBD中瞬时增加，仅在PD阶段特异性地富集于黑质神经元簇，形成独特的微环境。

6. α-Syn聚集体的空间分布和相关细胞反应

α-Syn免疫荧光分类显示，iLBD组织中α-Syn在腹外侧黑质中显著积累，PD组织中聚集体向内侧转移。α-Syn阳性点状区域在iLBD中主要定位于SC10，其次是SC0和SC11。伪批量DEG分析显示，iLBD中α-Syn阳性点状区域上调AGTR1、FST、RGS16和SLC35D3等与神经元易感性相关的基因，以及GBE1和PYGL等糖原代谢基因。PD中α-Syn阳性点状区域持续上调金属硫蛋白MT1F、MT1X、MT1G和MT1H。配体-受体（ligand-receptor, L-R）分析显示，iLBD中多个L-R对与α-Syn阳性点状区域显著空间关联，包括ECM配体和突触囊泡相关受体LAMA5–SV2C、LAMC1–SV2A以及MDK–SDC4、COL1A2–SDC4和CNTN1–NOTCH2。然而，这些iLBD富集的相互作用在PD样本中不显著，PD中仅COL27A1–(ITGA2–ITGB1)等少数相互作用被一致检测到，表明疾病进展过程中α-Syn相关L-R相互作用发生区域依赖性重组。

7. DEGs与PD风险位点的整合揭示群体特异性空间和转录汇聚

MAGMA基因集富集分析显示，在东亚（EAS）GWAS中，7个基因集经FDR校正后达到统计学显著，包括多个PD升高空间簇（PD_SC0、PD_SC4、PD_SC6、PD_SC8和PD_SC9）以及小胶质细胞轨迹基因集MIC_T1_ALL和MIC_T2_ALL。相比之下，在欧洲（EUR）GWAS中，没有基因集通过FDR校正。基因水平分析显示，两个群体间存在部分共享的遗传信号，如MIC_T1_ALL基因集中LRRK2和SNCA在两种人群中均被检测到，但EAS分析中的基因水平关联更丰富且支持更强，而EUR中相应信号通常较弱。这些结果表明，共享的细胞程序可能通过定量上不同的遗传架构在EAS和EUR队列中汇聚于PD风险。

四、讨论与结论

本研究的独特之处在于纳入了iLBD病例以捕获早期致病变化，并直接将转录组数据与α-Syn免疫反应性对齐，实现分子改变的空间锚定解读。研究证实α-Syn积累始于iLBD的外侧黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc），与已知的早期多巴胺能易感区域一致。在PD中，这些区域表现出广泛的结构崩溃，而内侧黑质区域和VTA相对保留。研究鉴定了NC3为转录上独特且高度易感的多巴胺能亚型，NC8的相对保留和适应性反应以及GABA能神经元分布的改变和胶质重塑，共同揭示了退行性黑质内协调的细胞重组。星形胶质细胞和小胶质细胞的两条不同轨迹反映了疾病相关胶质反应的时空分化，分别由不同的分子程序驱动。α-Syn阳性区域的L-R分析揭示了iLBD中突出的ECM重塑和突触黏附相关细胞间信号事件，而这些事件在晚期PD中大幅减弱。MAGMA整合分析表明，PD遗传风险与空间分辨的细胞状态程序和小胶质细胞动力学之间存在群体特异性耦合，东亚人群中多个基因集显著富集而欧洲人群中未达显著，提示不同祖先背景下PD遗传架构的定量差异。本研究提供了首个来自东亚PD队列的高分辨率、空间映射单核转录组资源，阐明了中脑细胞间和微环境中的早期扰动，这些扰动可能构成选择性多巴胺能易感性的基础，并为制定祖先信息指导的治疗策略提供了重要参考。